日本、意大利发现新型疯牛病病例

日本于 2 0 0 3年 10月 6日确认了在本国内发现的第 8例疯牛病。本例疯牛病除了患牛比较年轻 (只有 2 3月龄 )以外 ,导致该例疯牛病的致病因子 prion的糖基化类型、对蛋白酶的抗性及其在脑内的沉积部位明显不同于以前发现的 prion,因此很有可能是 prion的一个新型株。恰巧的是 ,意大利于 10月 16日给世界动物健康组织 ( OIE)报告 ,在其国内也发现了 2例与以往的疯牛病病例不同 ,但与日本发现的第 8例疯牛病很相似的病例。目前两国表示要进行合作研究 ,以揭示这种新型或非典型疯牛病致病因子的来源、致病特性、传播方式等。专家推测 ,导致…     

饲料原料中沙门氏菌的分离鉴定及侵袭蛋白A基因序列分析

采用PCR方法对235批饲料原料中沙门氏菌进行分离鉴定以及侵袭蛋白A(invA)基因检测和DNA序列分析,了解饲料原料中沙门氏菌分布情况以及invA基因核苷酸序列差异及蛋白结构,建立沙门氏菌的分子快速检测方法。结果发现分离检测出的沙门氏菌均来自肉骨粉,阿哥纳沙门氏菌(Salmonella agona)2株,山夫登堡型(S.senftenberg)沙门氏菌2株。核苷酸基因序列分析显示,invA基因较为保守,编码蛋白为疏水性蛋白,存在3个跨膜区域,同源性在99.4%～100%之间,系统发育树上分析不同血清型不在同一分支上。     

T-2毒素单抗制备及免疫学检测方法的建立

拟制备灵敏度高、特异性强的抗T-2毒素单克隆抗体,并初步建立T-2毒素阻断ELISA检测方法。采用N,N’-羰基二咪唑(CDI)法合成免疫原T-2-BSA和包被原T-2-OVA,经小鼠免疫、细胞融合、利用ELISA筛选技术筛选出分泌抗T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用腹腔注射细胞株制备腹水,并进行免疫学特性鉴定,初步建立T-2毒素阻断ELISA检测方法。结果显示,筛选出能稳定分泌抗T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1株命名为4F7,经鉴定该细胞株分泌的单克隆抗体(mAb)效价高达1.024×106,亚型为IgG1型,亲和力常数为1.49×10~(11) mol/L,IC50为2.19μg/L,检测限LOD为0.07μg/L,与其他霉菌毒素及载体蛋白BSA和OVA交叉反应率均小于0.01%。样品回收率为83.8%~94.3%,变异系数小于15%。本试验制备出了灵敏度高、特异性强、亲和力高的T-2毒素单克隆抗体,并建立了T-2毒素的阻断ELISA快速检测方法,为T-2毒素检测提供了技术支撑。     

网络天空

英国研究发现不只是BSE中含有普里昂蛋白英国研究人员认为,牛海绵状脑病(BSE)可能不是唯一与普里昂蛋白(prion)有关的脑病。prion可能不仅与BSE有关,而且还与牛的其他脑病有关。英国的科学家已经在患有一种罕见的神经退     

猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为了建立一种经济可靠的猪瘟病毒(CSFV)抗体检测方法,本研究利用杆状病毒表达系统表达可溶性CSFV E2蛋白,并免疫BALB/c小鼠,制备了45株可稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。经CSFV阳性血清阻断试验筛选出4株具有阻断活性的McAb,并经抗原表位鉴定确定单抗15A9识别的是可用于鉴别CSFV和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的线性表位TAVSPTTLR。利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的15A9建立了CSFV阻断ELISA抗体检测方法,用此方法检测猪瘟疫苗免疫的猪血清,免疫后2周即可检测到抗体,且该方法检测BVDV阳性血清为阴性。本研究建立的CSFV阻断ELISA抗体检测方法为CSFV的疫苗免疫效果评估及其与BVDV的抗体鉴别提供了一种有效、便捷的方法。     

朊病毒病治疗新进展

疯牛病、人的克雅氏症和绵羊的痒疫等由朊病毒 (prion)引起的疾病 ,其发病机理现在认为是 ,在 prion蛋白的诱导下 ,一种细胞的正常蛋白 Pr PC发生构象改变后在脑中积聚形成斑 ,破坏神经细胞的正常功能引起的。而最近的一项研究表明 ,针对 pri-on蛋白的几种抗体可以清除培养的小鼠脑细胞中积聚的 prion蛋白。如果这些抗体可以设计成能通过血脑屏障的话 ,就有望作为治疗这类疾病的新选择。除了这类抗体外 ,美国科学家发现 2种通常用来治疗疟疾和精神分裂症的化学药物 quinacrine(阿的平 )和 chlorpromazine,也能阻止感染小鼠脑细胞中的 prio…     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的可溶性表达、纯化及鉴定

为获得可用于猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)抗体检测的重组抗原Cap蛋白,根据GenBank中发表的PCV2 ORF2序列设计物,以PCV2 JS株基因组为模板,PCR扩增出无核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的ORF2基因片段,插入质粒pET-30a(+)构建重组表达质粒pET-ORF2ΔNLS,IPTG可诱导该重组菌表达约27 ku大小的重组蛋白。进一步分析发现该蛋白在大肠杆菌中主要以可溶性形式存在;镍柱亲和层析法纯化该蛋白,用PCV2阳性血清进行免疫印迹试验,结果发现纯化的重组蛋白能与PCV2抗体发生特异性反应,表明该纯化的蛋白具有很好的免疫反应原性,可用于临床样本中PCV2抗体的检测。     

新城疫病毒阳性选择区域氨基酸与毒力相关性研究

为研究新城疫病毒(NDV)不同蛋白在进化过程中是否受到阳性选择,以及阳性位点附近氨基酸与病毒毒力之间的联系,通过分子生物学方法,采用Codeml模式对23株NDV开展选择压力研究。结果在F蛋白检测出2个阳性选择位点(9I、20V),L蛋白检测出1个阳性选择位点(1686S)。对正选择压力位点附近氨基酸进一步分析显示,F蛋白信号肽区第19位氨基酸与病毒毒力呈现一定的相关性,该位点为异亮氨酸(I)的毒株多为强毒株,而弱毒株以丙氨酸(A)和缬氨酸(V)为主。研究结果为NDV毒力的快速鉴定、疫苗株的抗原性筛选等提供了参考。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素单克隆抗体的制备及鉴定

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素的融合蛋白。用纯化的紧密素蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经4次有限稀释法克隆,成功获得2株能稳定传代并分泌抗紧密素单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。2株单抗分别制备腹水,ELISA检测效价分别为5.2×104,2.5×104。Western blot检测表明,2株单抗与融合蛋白发生特异性反应;ELISA检测表明,2株单抗可特异性检出大肠杆菌O157:H7。本研究为建立大肠杆菌O157检测方法提供了物质基础。     

饲用大豆全株蛋白含量关联SSR标记筛选

提高全株蛋白含量是饲用大豆(Glycine max)最重要的育种目标。为筛选可用于饲用大豆全株高蛋白含量育种实践的有效分子标记,本研究以甘肃省农业科学院大豆育种课题组前期筛选的55份饲用大豆核心种质资源作为供试群体材料,以大豆鼓粒期全株蛋白含量为目标性状,利用国内外文献报道的40个蛋白含量相关SSR标记对受试群体遗传多样性、群体结构进行分析,通过一般混合线性模型(GLM)和混合线性模型(MLM)两种模型对大豆全株蛋白含量与标记进行关联分析。结果表明,从40个SSR标记中筛选出多态性高、重复性好的标记21个,利用这21个SSR标记在群体中共检测出118个等位变异,每个标记的等位基因数变幅为3～10个,平均为5.6个;利用遗传相似度UPGMA聚类分析可将55份材料分成I、II、III 3类,遗传结构分析可分成POP1、POP2、POP3、POP4共4个亚群,两种方法分类结果不尽相同但基本相似;两种模型同时检测到6个SSR标记与全株蛋白含量显著相关(P <0.05),可用于全株高蛋白含量饲草大豆分子标记辅助选择育种实践。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2主要抗原区域的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

本研究以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HPPRRSV)重组NSP2蛋白为包被抗原,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。通过RT-PCR技术,从PRRSV SCMS08株中,成功扩增出NSP2的主要抗原区域。将其克隆到pET-32a(+),成功构建原核表达载体,并转化宿主菌(E.coli)Rosetta 2(DE3)。以镍柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE检测证实重组蛋白获得了高效表达,Western blot检测表明所表达蛋白能够被抗组氨酸标签单克隆抗体和PRRSV阳性血清识别。以此蛋白包被酶标板,初步建立了PRRSV NSP2-ELISA诊断方法。优化的NSP2-ELISA的最佳抗原包被浓度为1.7μg·mL-1,血清的最佳稀释度为1∶40。用该方法检测185份血清样品,与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果符合率为90.8%。建立的间接ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征的常规诊断及流行病学调查。     

肠炎沙门菌非编码小RNA RyhB调控SopE蛋白的表达研究

为研究肠炎沙门菌(SE)50336非编码小RNA(RyhB-1、RyhB-2)对毒力蛋白SopE的调控作用,利用pET原核表达系统表达SE50336 SopE蛋白,免疫BALB/c小鼠获得SopE蛋白的特异性多克隆抗体(多抗)并分析制备血清的特异性。通过Western-blot检测野生株SE50336、RyhB单缺失株(SE50336 ΔryhB-1、SE50336 ΔryhB-2),以及RyhB双缺失株(SE50336 ΔryhB-1ΔryhB-2)中SopE蛋白的表达水平,分析RyhB对SopE的调控作用。结果显示:成功构建重组质粒pET28a-sopE,转化BL21(DE3)感受态细胞后,在IPTG 0.3 mmol/L、温度37℃、转速220 r/min、诱导时间4 h的条件下,SopE蛋白在包涵体中表达;Western-blot结果显示制备的多抗可特异性检测肠炎沙门菌SopE蛋白;与野生株相比,RyhB单缺失株SopE蛋白表达量下降,双缺失株下降更明显,表明RyhB-1和RyhB-2均可上调SopE蛋白的表达。以上结果为进一步研究RyhB-1和RyhB-2对SopE的调控作用机制奠定基础。     

朊蛋白基因家族在畜牧兽医中的研究进展

朊蛋白基因PRNP作为朊蛋白基因家族的一员,其编码的异常朊蛋白(prion)导致传染性海绵样脑病(TSEs)的发生。PRNP基因在定位、结构、表达和编码产物上与朊蛋白基因家族其他3个基因(PRND,PRNT和SPRN)存在很多相似之处,且该基因家族在不同种属之间十分保守,朊蛋白基因家族因此被称为"朊蛋白基因复合体"(prion gene complex)。已有资料表明,朊蛋白基因家族除了与TSEs的发生密切相关,其还对畜牧生产和兽医预防有着重要影响。论文介绍了朊蛋白基因家族的4个基因及其编码产物,而后依次阐述了该基因家族对畜牧生产的影响以及在兽医预防中的研究进展,以期为畜牧生产和兽医预防提供参考。     

2型猪链球菌强毒株与非致病株胞外蛋白的比较蛋白质组初步研究

为建立2型猪链球菌(S.suis 2)胞外蛋白组双向电泳样品的制备方法,本研究利用双向电泳(2-DE):分离S.suis 2强毒株与无致病株的胞外蛋白,分别得到它们的胞外蛋白图谱.在pH4～pH7范围内采用考马斯亮蓝R350染色法在2菌株的胞外蛋白质图谱中都分别检测出180±10个蛋白点.并且它们的蛋白质分子质量分布基本相似;在所检测到差异蛋白点中,其中有50个蛋白点只存在于无致病菌株中而强毒株中不存在,有52个蛋白点只存在于强毒株中而无致病菌株中不存在,有7个蛋白点在2菌株中的表达量相差5倍以上.我们在强毒株凝胶中挑取了10个差异蛋白点进行质谱分析,通过数据库检索,鉴定了其中的9个蛋白,另外1种与鞭毛蛋白有同源序列.这些结果为研究S.suis2的致病机理提供了蛋白质组学方面的信息.     

一株抗猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备抗猪脑心肌炎病毒(EMCV)HB10株VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达系统表达的重组VP2蛋白(r VP2),纯化后将其免疫BALB/c小鼠,取免疫的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出一株稳定分泌抗VP2 MAb(1D3)。通过间接免疫荧光试验和western blot对该MAb的免疫活性和特异性进行鉴定,结果表明1D3 MAb仅能够特异性与EMCV全病毒反应。此外,通过构建截短的VP2蛋白重组质粒,采用western blot的方法对VP2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 1D3识别的线性表位区域为89DGGVFGAALRRH100。本实验结果为进一步研究VP2蛋白的功能及建立EMCV检测方法奠定了基础。     

嗜水气单胞菌J-1株外膜蛋白Omp38的抗原性分析

根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白Omp38的基因序列设计引物,以Ah J-1株基因组为模板,扩增omp38基因片段,定向克隆至表达质粒pET32 a中,将重组原核表达质粒pET32 a-omp38转化至大肠杆菌BL21,诱导表达出分子量约35 ku的重组蛋白。用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA检测抗体效价为1∶25 600,表明该蛋白有良好的免疫原性。PCR检测表明,omp38基因可在73%(22/30)的嗜水气单胞菌中发现。重组蛋白抗血清与30株嗜水气单胞菌分离株进行凝集试验,所有分离株均可在不同程度上发生反应,表明该重组蛋白是一种潜在的共同保护性抗原,可作为基因工程亚单位疫苗的候选成分。     

朊蛋白多肽PrP 106-126对N2a细胞活性及PrP mRNA表达的影响

朊病(prion disease)是由正常细胞朊蛋白PrPC错误折叠成异常朊蛋白(朊病毒)引起的.朊病毒的神经致病性在病理学上表现为神经元空泡化、神经元丧失和胶质增生等.     

多重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒

为了检测、区分猪传染性胃肠炎(TGE)和猪流行性腹泻(PED)，建立了同时检测这2种疾病痛原体的多重PCR方法。参考GenBank登录的TGEV和PEDV纤突蛋白S基因序列，经DNAsis 2．0比较分析。分别筛选出TGEV、PEDVS基因相对保守区。以TGEV TH-98株(GenBank登陆号为AF494337)和PEDV CV777株(GenBank登陆号为NC003436)为参考模板，利用软件Primer3设计合成了2对寡核苷酸引物，以ST细胞培养的TGEV和PEDV毒株核酸为模板。利用所设计的2对引物进行多重RT-PCR扩增，结果同时得到与试验设计相符的499bp(TGEV)和199bp(PEDV)的扩增条带。而对其他3种猪病原的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明。建立的多重RT-PCR方法可检测出10pgTGEV RNA和100pg PEDV RNA。     

猪链球菌2型人源株MRP的表达及其单克隆抗体的制备与应用

将猪链球菌2型(SS2)人源株Habb mrp基因进行截短修饰后,克隆于pGEX4T-2载体中,转化大肠杆菌诱导表达约61 000的融合蛋白MRP-GST,该蛋白经凝血酶作用去除重组蛋白中的GST标签,得到约35 000纯化的MRP.Western blotting证实MRP可被SS2阳性血清特异性识别.以纯化的MRP抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,间接ELISA进行筛选获得了6株能稳定分泌抗MRP特异性单抗的细胞株.特异性试验表明该6株单抗与SS2的另外2种蛋白、大肠杆菌均不发生交叉反应.以2138单抗腹水和SS2多克隆抗血清建立夹心ELISA对71株标准菌株和122株猪链球菌野毒株进行MRP的表征鉴定,标准株检测结果与背景符合率为为97.2%(69/71),其中34株标准血清型菌株检测的符合率为100%.表明该方法可用于猪链球菌的快速诊断和流行病学调查.     

大鼠细小病毒VP2原核表达及间接ELISA方法建立

本研究以大鼠细小病毒(Rat parvovirus,RPV)VP2基因的原核表达产物为抗原建立检测RPV抗体的间接ELISA方法。通过比对分析大鼠细小病毒不同毒株的VP2蛋白序列,我们筛选出了RPV株VP2蛋白上长度为378 bp的特异性成熟肽序列,随后构建了pET30a原核表达体系,借助His标签对重组表达产物进行纯化,以纯化鉴定后的表达产物为抗原,免疫Balb/c小鼠制备多抗血清并建立检测大鼠细小病毒血清抗体的间接VP2-ELISA方法。结果显示,抗原包被质量浓度为0.28μg/mL,阳性判定标准初步定为OD450≥0.5,与H-1株和KRV株的阳性血清存在一定的交叉反应,批内试验变异系数小于10%。本研究建立的RPV VP2-iELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于大鼠细小病毒感染的血清抗体检测。