鳗鲡外周血淋巴细胞转化试验培养条件的初步研究

探讨鳗鲡外周血淋巴细胞转化试验的最优条件,为鳗鲡的细胞免疫研究提供方法。通过对培养时间、培养温度、小牛血清和刀豆蛋白A(ConA)浓度4个参数的测定,初步确定了鳗鲡外周血淋巴细胞转化试验四甲基偶氮唑(MTT)法的培养条件。结果表明,在培养时间60 h和68 h,培养温度为18.0℃、24.0℃、30.0℃,RPMI细胞培养液中小牛血清浓度为5%、10%和15%,ConA浓度为0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的范围内,淋巴细胞于18.0℃、含10μg/mL ConA和15%小牛血清的营养液中培养68 h后可获得相对最好的淋巴细胞转化效果。     

粘虫胚胎细胞继代培养条件的研究

对粘虫胚胎细胞的继代培养条件进行了研究。结果表明,ＴＣ－１００（ＳＩＧＭＡ）培养基最适合细胞生长。不同血清浓度和ｐＨ的培养基对细胞生长影响很大,以１０％小牛血清浓度和ｐＨ６．２的培养基对细胞传代培养最为适宜。细胞生长依赖于细胞接种密度,以 ５×１０~５细胞／ｍＬ细胞接种密度对细胞生长最为适宜。适于细胞培养的最适温度范围是２６－２９℃。     

金鱼疱疹病毒敏感细胞的体外培养

采用组织块法和胰蛋白酶消化法对金鱼细胞进行体外培养和传代，研究了高倍稀释，培养液中的小牛血清浓度以及冷冻保存等因子对显示较高的增殖能力的来源于鳍的细胞GFF的影响进行了试验；并在其进行金鱼疱疹病毒接种、病毒传代培养等试验和电子显微镜观察。结果不论是高倍稀释，还是在低浓度小牛血清培养液H－MEM－5中培养，细胞均具有足够的增殖速率，而且冷冻保存细胞在解冻后的培养仍然具有较好的增殖能力，细胞的存活率在85％以上，使此细胞的冷冻保存成为可能；同时接种细胞出现了CPE且病毒传代培养的细胞内和培养液中均观察到病毒颗粒，表明GFF细胞可以支持病毒的增殖，为研究金鱼病奠定了基础。     

金鱼疱疹病毒敏感细胞的体外培养

采用组织块法和胰蛋白酶消化法对金鱼细胞进行体外培养和传代，研究了高倍稀释，培养液中的小牛血清浓度以及冷冻保存等因子对显示较高的增殖能力的来源于鳍的细胞GFF的影响进行了试验；并在其进行金鱼疱疹病毒接种、病毒传代培养等试验和电子显微镜观察。结果不论是高倍稀释，还是在低浓度小牛血清培养液H－MEM－5中培养，细胞均具有足够的增殖速率，而且冷冻保存细胞在解冻后的培养仍然具有较好的增殖能力，细胞的存活率在85％以上，使此细胞的冷冻保存成为可能；同时接种细胞出现了CPE且病毒传代培养的细胞内和培养液中均观察到病毒颗粒，表明GFF细胞可以支持病毒的增殖，为研究金鱼病奠定了基础。     

牛体外受精胚胎无血清培养的研究

以TCM199为基础液,对常规IVM/IVF牛早期胚胎进行了无血清（1mg/ml,PVA,聚乙烯醇）和有血清（20%FCS）培养的对比实验。通过在无血清培养液中加入9种添加物,初步筛选出了在5%CO#-2、95%空气、39℃、饱和湿度培养环境下的牛体外受精胚胎无血清培养体系为：TCM199+EDTA0.1mmol/L+I5μg/ml+T5μg/ml+S5ng/ml+EGF10ng/ml+牛磺酸7mmol/L+亚牛磺酸5mmol/L+PVA1mg/ml+青霉素100iu/ml+链霉素100mg/ml。无血清培养与有血清培养囊胚率（7.1%对14.3%）、扩展囊胚率（4.3%对7.1%）,均无显著差异(P > 0.05)。实验结果还表明,外源激素（雌激素和孕酮）对胚胎发育无促进作用;有血清组与无血清组胚胎的各发育阶段（桑椹胚、囊胚、扩展囊胚）细胞核数量无明显差异（P > 0.05）。     

石鲽外周血细胞的培养及染色体制备条件的探讨

以石鲽(Kareius bicoloratus)为试验材料研究探讨其外周血细胞培养及染色体制备的条件方法。用RPMI1640全血培养基进行培养,从血液保存时间、刺激源PHA(植物血球凝集素)和ConA(刀豆蛋白A)等方面对外周血淋巴细胞的培养及其染色体制备条件进行探讨,建立较成熟的石鲽外周血淋巴细胞培养及染色体制备的方法。结果表明:血液于4℃保存3d后用全血培养基进行培养,细胞仍可正常生长;在16℃培养温度下,ConA和PHA两种刺激源均能促进石鲽外周血淋巴细胞的分裂增殖,培养时间以72h最好;从培养的血细胞形态和白细胞数目来看,以ConA为刺激源的作用效果好于以PHA为刺激源的作用效果;5ml培养基中加入0.2ml全血,16℃下用终浓度为0.1mg/ml的ConA为刺激源培养72h,在结束培养前4h加入终浓度0.6μg/ml秋水仙素,0.075mol/L的氯化钾低渗35min可获得较好的染色体分裂相。     

犬红细胞培养上清液对淋巴细胞增殖转化的影响

无菌采取犬血、肝素抗凝、分离出红细胞,制备不同浓度的红细胞悬液,接种24孔板中进行培养,在培养不同时间分别收集红细胞培养上清液,采用淋巴细胞增殖转化试验,检测其单独及协同不同丝裂原(PHA-P、ConA和LPS)对犬淋巴细胞增殖转化的影响,淋转结果用MTT法测定。结果显示,无论单独或是协同不同丝裂原(PHA- P、ConA和LPS),红细胞培养上清液对淋巴细胞均有明显的促增殖转化作用(P<0．05);单独及协同丝裂原PHA-P、ConA和LPS刺激淋巴细胞时,红细胞浓度分别为1×108,1×109,5．0×107和1×108mL1,培养时间分别为56,72, 56和72 h的红细胞培养上清效果最佳。表明,犬红细胞培养上清液对犬淋巴细胞的增殖转化有明显的促进作用。     

感染后家蝇幼虫离体血细胞及培养上清中2种酶活性的变化

[目的]探讨大肠杆菌感染后家蝇三龄幼虫血清中酸性磷酸酶（ACP）、过氧化物酶（POD）活性升高的机制。[方法]家蝇三龄幼虫离体培养血细胞中加入大肠杆菌菌液,于离体培养后48、1、2、16 h测定血细胞及培养上清中ACP、POD活性的变化。[结果]（1）大肠杆菌感染后各时间组培养上清和离体血细胞中ACP活性显著高于CK（P〈0.01）。其中培养上清和离体血细胞中ACP活性分别在感染12 h8、h达高峰,然后逐渐下降。（2）大肠杆菌感染后各时间组培养上清和离体血细胞中POD活性显著高于CK（P〈0.01）。其中培养上清和离体血细胞中POD活性分别在感染12 h4、h达高峰,然后逐渐下降。[结论]家蝇幼虫血细胞脱颗粒释放ACP、POD是引起感染后血清中这2种酶活性升高的主要机制。     

猪链球菌2型溶血毒素的产生条件及其特性分析

猪链球菌２型江苏分离株ＨＡ９８０１产生一种溶血毒素,培养条件影响其产量。最佳培养条件为Ｔｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔ肉汤（ｐＨ７．５）中接种Ｖ（种子液）：Ｖ（肉汤）＝１：１００的种液,３７℃静置培养１２ｈ。培养基中的胰蛋白的胨对该溶血素的产生起决定性作用。该溶血素可被还原剂活化,被氧化剂和胆固醇及蛋白酶Ｋ抑制,亦被抗链球菌溶血素Ｏ阳性血清和抗猪链球菌２型全菌阳性血清抑制。该溶血素在－２０℃较稳定,在４,２     

小鼠胚胎成纤维细胞分离培养研究

为探索实验室影响小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离和培养的因素,取昆明白小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对不同胎龄、不同血清浓度、不同胰蛋白酶浓度和作用时间对MEF分离及培养的影响进行研究,观察MEF的生长形态及其生物学特性.结果表明,在实验室条件下,12.5～14.5 d胎龄的小鼠胎儿MEF分离效果最好;最佳培养基为DMEM添加15;小牛血清;第3代细胞增殖最旺盛;室温条件下,0.125;胰蛋白酶消化MEF时间以8～10 min为宜.在培养ES细胞时,应选择第3～5代的MEF作为饲养层细胞.研究获得了可在实验室分离制备MEF的方法,为实验室进一步分离培养ES细胞奠定基础.     

牛初乳粉对调节免疫低下大鼠免疫功能的研究

研究牛初乳粉对免疫低下大鼠免疫功能调节作用,初步探讨其机制.将SD大鼠随机分为3组,空白对照组、模型组、牛初乳粉组,每组大鼠10只,其中模型组、牛初乳粉组肌注免疫抑制剂氢化可的松建立SD大鼠免疫低下模型,牛初乳粉组用牛初乳粉干预14 d后,测定几项免疫指标.实验表明,牛初乳粉可以明显提高免疫低下大鼠血中白细胞数;牛初乳粉对免疫低下大鼠脾脏具有保护作用;牛初乳粉可以明显提高淋巴细胞增殖能力,增强免疫低下大鼠抗体分泌细胞分泌功能,提高血清溶血红素的含量;牛初乳粉可以明显提高免疫低下大鼠血清白介素-1的含量,有增加血清白介素-2、肿瘤坏死因子含量的趋势.实验还表明,牛初乳粉具有免疫调节作用,其机制与牛初乳粉明显提高大鼠血清白介素-1、血清白介素-2、肿瘤坏死因子含量有关.     

不同牛血清促悬浮培养BHK21细胞生长的作用

[目的]验证成年牛血清在细胞培养过程中对细胞的促生长作用。[方法]分别以商品胎牛血清、新生牛血清、处理的成年牛血清进行悬浮培养BHK21细胞,通过细胞密度、细胞活力等指标来检测各血清对细胞的促生长作用。[结果]3种血清对细胞的促生长作用差异不明显,都具有良好的促细胞生长作用。[结论]处理的成年牛血清具有良好的促细胞生长作用,与胎牛血清、新生牛血清促细胞生长作用差异不明显。     

乳铁蛋白牛初乳颗粒增强免疫调节作用的研究

评价乳铁蛋白牛初乳颗粒增强免疫力作用,为该产品提供功能学资料。采用SPF级雌性小鼠,设0.200,0.04,1.200 g/kg(分别相当于人体推荐量的5,10,30倍)3个剂量组,每日1次经口给予小鼠相应浓度的受试样品,连续给样1个月。检测对小鼠体重、胸腺、脾脏器官、ConA诱导的脾淋巴细胞转化、DNFB诱导的DTH、溶血空斑数、血清半数溶血值(HC50)、碳廓清能力、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞、NK细胞活性的影响。结果表明:细胞免疫功能、体液免疫功能、NK细胞活性均与对照组有显著差异,认为该乳铁蛋白牛初乳颗粒具有增强免疫力功能效果(P<0.05)。     

胎牛血清和新生牛血清体外培养动物细胞的效果比较

为了比较进口胎牛血清、国产胎牛血清和国产新生牛血清的细胞培养效果,以2批进口胎牛血清、3批国产胎牛血清和2批国产新生牛血清为试验材料,采用细胞贴壁传代培养、最大增殖浓度和倍增时间以及集落形成率3种方法,比较了7批供试血清对VERO、CHO-K1、MDCK和Hela 4种细胞的培养效果。结果表明:连续传代培养时所有牛血清均有较好的促细胞生长的效果;进口胎牛血清、国产胎牛血清和国产新牛血清对4种细胞的平均最大增殖密度为67.8×104、62.1×104和64.8×104 cfu·mL-1,平均倍增时间为22.2、22.5和22.7h;对VERO、CHO-K1和Hela细胞的平均集落形成率为59.2%、57.6%和50.9%。3种牛血清对群体性细胞培养时效果差别不明显,对单细胞克隆培养时胎牛血清优于新生牛血清。     

黄牛白细胞介素-2基因的克隆与序列分析

为了克隆黄牛IL-2基因,采用RT-PCR技术,用ConA刺激12 h的黄牛颈部外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出黄牛IL-2基因,琼脂糖凝胶电泳技术显示扩增片段约为500 bp,分离纯化,将其克隆到PDM18-T载体,重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定以及核苷酸测序。结果显示,克隆的黄牛IL-2基因大小468 bp,与GenBank中报道的水牛、牛、绵羊、猫、马、鸡、犬、人、山羊、鼠、猪IL-2基因比较,同源性分别为98.9%;98.5%;97.0%;82.4%;79.9%;5.3%;78.2%;79.7%;95.9%;65.2%;84.7%。     

刀豆凝集素的血凝活性及其性质研究

[目的]为进一步研究刀豆凝集素提供依据。[方法]从豆科植物刀豆属(Canavalia)中Canavalia ensiformis(L.)DC的干燥成熟种子中提取刀豆凝集素(Concanavalin A,简称ConA),进行血凝活性测定,并对其部分性质作了初步研究。[结果]结果表明:采用胰蛋白酶修饰人血(A型)红细胞来检测ConA凝集活性时,发现其活性提高了8倍。ConA对人A、B、O、AB型及供血动物(兔,鸡,鸭,鸽,鲤、鲫鱼)的血红细胞都具有一定程度的凝集活性,无供体细胞专一性或血型专一性;D-葡萄糖和D-甘露糖是ConA的专一性结合糖。ConA是一种对热较稳定的凝集素,40℃以下时ConA很稳定,80℃以上保温20 min后,血凝活性完全丧失。在pH值范围5.8~8.3,ConA的凝集活性较高,在pH>11.9时,凝集活性完全丧失。变性剂脲浓度达到0.4 mol/L以上时,ConA的凝集活性可完全丧失。[结论]该研究对今后系统阐明其生物学作用,扩大应用范围具有重要意义。     

‘和牛’ב秦川牛’F_1代血清生化指标、肝脏食用品质及其相关性的分析

为了研究‘和牛’ב秦川牛’F1代杂交牛的血液和肝脏特性,以F1代杂交牛作为试验组,‘秦川牛’为对照组,测定了2种牛的血清指标和肝脏食用品质.结果发现:杂交牛血清中K+离子浓度达7.66mmol/L,HDL浓度为1.91mmol/L,LDH浓度达1 994.00U/L,均极显著高于‘秦川牛’(P<0.01).杂交牛肝的a*值显著高于‘秦川牛’(P<0.05),b*值极显著高于‘秦川牛’(P<0.01).杂交牛肝的pH1值、失水率显著低于‘秦川牛’肝脏(P<0.05),熟肉率显著高于‘秦川牛’肝脏(P<0.05).对杂交牛的血清生化指标和肝脏食用品质进行了相关分析,通过主成分分析法确定AST,K,T4为血清代表性指标,建立了食用品质与血清指标的最优回归方程.     

基于小鼠粪便气味信息的牛乳清蛋白功能效果的鉴别区分

以电子鼻气敏传感器阵列跟踪牛乳清蛋白干预小鼠粪便气味,以期建立基于气味信息无损评价牛乳清蛋白功能的新方法。动物实验结果表明,与NS组比较,给药牛乳清蛋白试验组血清中的超氧化物歧化酶(SOD)活性上升,丙二醛(MDA)含量显著下降,牛乳清蛋白在小鼠血清中具有抗氧化的能力。电子鼻实验单因素方差分析发现,样品量、顶空生成时间、顶空生成体积和载气流速对传感器S5影响均不显著,对其他传感器响应信号的影响显著。结合典则判别分析获得电子鼻检测较佳条件为:样品量1粒,顶空生成时间10 min,顶空生成体积150 mL,载气流速200 mL·min^-1。结合主成分分析和典则判别分析,电子鼻基本可将牛乳清蛋白不同灌胃剂量与对照组小鼠粪便样品区分,并区分不同灌胃剂量的不同周期组小鼠粪便样品。采用多元线性回归分析建立了小鼠体重的预测(R²=0.122 7),效果尚可。典型相关分析结果表明,粪便电子鼻气味信息与其生理指标两者有着极好的相关性,关联性较强。基于干预小鼠粪便气味信息,可以实现牛乳清蛋白干预与对照药物处理的区分,为食品体内功能性无创评价提供了方法思路。