白斑综合征病毒单克隆抗体的制备及BA-ELISA方法的建立

白斑综合征病毒(white spot syndrom virus,WSSV)是甲壳类动物的重要病原,作者采用提纯的WSSV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,共得到3株能特异分泌抗WSSV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞(1E9、1E10、4F5)。将3株杂交瘤细胞注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶104¹05。1E9、4F5的抗体亚型均为IgG1,1E10的抗体亚型为IgG2b。特异性实验表明:3株单抗与虾类病原桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、哈维氏弧菌(V.harveyi)均无交叉反应。Western bolt分析表明:单抗1E9与病毒28kD外膜蛋白特异性结合。采用生物素标记纯化后的单抗1E9,并建立了生物素-亲和素酶联免疫吸附法(Biotin-Adivin ELISA,BA-ELISA)用于WSSV的检测,该方法对提纯病毒的检测灵敏度约为4 ng,对病虾血淋巴的检测灵敏度达1∶25000。     

一种改进的对虾白斑综合征病毒提纯方法

对虾白斑综合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白在提纯的过程中易脱落,用传统的密度梯度离心方法不易获得完整的病毒粒子,对传统的蔗糖密度梯度离心方法加以改进后,可以获得大量完整的病毒粒子.用患白斑综合征病毒病的中国对虾鳃制备WSSV粗提液,感染螯虾(Cambarus proclarkii),选取25%的蔗糖溶液用作病虾鳃的匀浆液,然后经蔗糖密度梯度离心,分取各带负染后电镜观察,大量完整的病毒位于46% ～52% 蔗糖梯度之间,病毒粒子末端带有很长的尾;而病毒裸露的核衣壳位于40%～46%蔗糖梯度之间;在57%～62%之间观察到较多完整病毒粒子和少量细菌.实验结果表明改进的病毒提纯方法较好,可得到大量完整的带嚢膜的病毒颗粒.     

PCR检测对虾白斑综合征病毒的组织特异性

该研究提取了95%酒精保存的病虾组织(鳃、肌肉、表皮、附肢和复眼)的基因组总DNA,并进行了对虾白斑综合征病毒的PCR检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示,病虾组织(鳃、肌肉、表皮、附肢和复眼)有轻微的跑带现象,鳃和肌肉比表皮、附肢和复眼的基因组总DNA电泳条带亮。PCR检测结果发现,对虾不同组织的阳性检出率高低顺序如下:鳃肌肉=表皮附肢复眼。研究结果说明,鳃和肌肉可作为对虾白斑综合征病毒PCR检测的合适部位。     

对虾白斑综合征病毒(WSSV)致病相关基因研究进展

介绍了最近几年白斑综合征病毒WSSV致病相关基因的研究进展,包括病毒囊膜蛋白基因、核衣壳蛋白基因、病毒复制过程的关键酶基因、细胞因子受体基因、潜伏相关基因和抑制宿主细胞凋亡机制的基因等。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核蛋白单克隆抗体的制备和初步鉴定

克隆了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CC-11株的N基因全序列,将其克隆至原核表达载体pET28a,转化E.coliRosetta株后经0.5 mmol/L IPTG诱导,获得了高水平表达。对表达的N蛋白进行纯化,以50μgN蛋白免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,通过间接ELISA筛选,获得9B12、7C2、7C6共3株稳定分泌抗PRRSV-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,亚型鉴定结果分别为IgG2b、IgG1、IgG1亚型。通过Western blot分析和间接免疫荧光测定表明,3株单抗对PRRSV CC-11株、CH-1R和JXA1-R细胞毒以及4份临床疑似病料均发生特异性反应。     

白斑综合征病毒（WSSV）感染淡水枝角类的初步研究

采用WSSV发病对虾组织碎块投喂、WSSV粗提液投浸、WSSV粗提液浸泡过的金黄色葡萄球菌和酵母菌投喂对淡水枝角类进行白斑综合征病毒（WSSV）攻毒,然后将攻毒前后的淡水枝角类进行PCR检测。结果表明,投喂WSSV粗提液浸泡过的金黄色葡萄球菌可以感染淡水枝角类。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2的原核表达及单克隆抗体的制备

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为模板,通过RT-PCR扩增编码非结构蛋白2 (Nsp2)的基因,插入到pET32a表达载体中并在大肠埃希氏菌中进行表达.SDS-PAGE电泳结果显示融合表达的Nsp2分子量约为68 kDa,Western blotting分析该融合蛋白能与PRRSV阳性血清发生特异性反应.纯化融合表达产物Nsp2,按100 μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化,经腹腔免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,分别以Nsp2和His-Tag为抗原,通过间接EL ISA方法对融合细胞的上清液进行检测,筛选阳性克隆.经过3次亚克隆后,最终得到了6株能稳定分泌抗Nsp2抗体的阳性细胞克隆株.间接免疫荧光试验、Western blotting和间接ELISA试验鉴定这6株单克隆抗体均能够特异、单一地识别Nsp2,亚型鉴定结果显示6株单抗均属IgG2a型,其轻链均为κ链.所制备的这些单抗将为鉴定PRRSV Nsp2的B细胞抗原表位以及分析该蛋白的结构和功能奠定基础.     

凡纳对虾白斑综合征病毒的检测和预防

20世纪 90年代以来 ,日本、泰国、中国等许多亚洲国家和地区因虾病流行 ,对虾养殖产量锐减 ,造成重大经济损失。其中危害最严重的就是白斑综合征 (ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ ,ＷＳＳ) ,其病原体为白斑综合征病毒 (ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ ,ＷＳＳＶ) [1 - 3] 。 1 993年 5 - 8月 ,我国沿海从南到北对虾养殖场发生了大面积的对虾爆发性流行病 ,损失非常严重[4,5] 。关于ＷＳＳ的研究已成为近年来国内外水产养殖病害研究的热点[6- 1 2 ] 。随着ＷＳＳＶ研究的深入 ,有关ＷＳＳ的病原、病理、诊断方法、检测技…     

凡纳对虾白斑综合征病毒的检测和预防

20世纪 90年代以来 ,日本、泰国、中国等许多亚洲国家和地区因虾病流行 ,对虾养殖产量锐减 ,造成重大经济损失。其中危害最严重的就是白斑综合征 (ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ ,ＷＳＳ) ,其病原体为白斑综合征病毒 (ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ ,ＷＳＳＶ) [1 - 3] 。 1 993年 5 - 8月 ,我国沿海从南到北对虾养殖场发生了大面积的对虾爆发性流行病 ,损失非常严重[4,5] 。关于ＷＳＳ的研究已成为近年来国内外水产养殖病害研究的热点[6- 1 2 ] 。随着ＷＳＳＶ研究的深入 ,有关ＷＳＳ的病原、病理、诊断方法、检测技…     

感染白斑综合征病毒的斑节对虾免疫酶变化特征

研究了斑节对虾(Penaeus monodon)感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)后的发病情况和4种免疫酶活性的变化特征。通过对斑节对虾进行WSSV急性攻毒试验,发现在感染50h左右出现死亡高峰,感染60h后大部分死亡虾出现明显的白斑。血液酚氧化物酶(PO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)活性在感染WSSV后都呈现先降低再升高再降低的趋势,并在感染后60h左右,活性达到最大值。肝脏、肌肉组织中的ACP、SOD活性变化规律与其在血液中的变化类似,肝脏中的ACP、SOD活性明显高于肌肉组织中的活性。     

不同靶点shRNA干扰对虾白斑综合征病毒增殖效果分析

设计合成了靶向对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因组不同佗点的5个shRNA:RR9、RR1、DP1、DP2和PK1,并在凡纳滨对虾体内实施了RNA干扰(RNAi)抗WSSV增殖的试验.结果显示:5个shRNA不同程度地抑制了WSSV的复制,降低了对虾的死亡率,其中,靶向病毒核糖核酸还原酶的shRNA RR9的RNA干扰效果最佳.     

不同温度下哈维氏弧菌和白斑综合症病毒对凡纳滨对虾的致病性

在不同温度[(19±1)、(25±1)、(31±1)℃]条件下,研究了不同浓度哈维氏弧菌Vibrio harveyi和白斑综合症病毒(WSSV)对凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei(体长8.12 cm±0.83 cm)的致病性。结果表明:温度为(19±1)℃时,整个试验过程中对虾死亡率均低于8.9%,各组病毒携带量低于3.9×104copy/g;温度为(25±1)℃时,病毒单独感染组对虾的死亡率和病毒携带量(最大值71.1%,1.9×105copy/g)和高浓度继发感染组的死亡率和病毒携带量(最大值77.8%,3.2×106copy/g)从试验中期开始明显高于其他组,死亡加快,病毒携带量迅速增加,单独感染细菌组死亡率随感染浓度的升高而升高(最大值为21.1%);温度为(31±1)℃时,病毒单独感染组的死亡率和病毒携带量(最大值47.8%,2.2×104copy/g)从试验中期开始明显低于继发感染组(最大值80.0%,6.1×106copy/g),单独感染细菌组的累积死亡率随细菌浓度的升高而升高(最大值24.4%)。研究表明,温度对WSSV和哈维氏弧菌的致病力影响显著,继发感染和细菌单独感染随温度的升高致病力升高,高温和低温对WSSV的致病力有抑制作用。     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的囊膜蛋白.将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶NdeⅠ、Xho Ⅰ酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a(+)表达载体上.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后成功地构建了VP28基因原核表达载体pET-28a-VP28.转化菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示含有与预期大小一致的约30 ku蛋白带,主要以包涵体形式表达.采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95％的大肠杆菌重组蛋白VP28.该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量.实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14 μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45％.这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合征奠定了基础.     

家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力的影响

为研究饲料中添加家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力的影响,在基础饲料中分别添加家蝇抗菌肽提取物0、1、2、3、4、5 g/kg,配制6种试验饲料.选取960尾健康、初始体均重为0.86(±0.01)g的凡纳滨对虾,分为6组,饲养8周后进行攻毒试验.结果显示,当抗菌肽提取物添加量为3 g/kg时,72 h内的累计死亡率与对照组相比显著降低.血细胞数量和吞噬率均以3 g/kg组最高,显著高于对照组、1、5g/kg组.当抗菌肽提取物添加量为2～3 g/kg时,对虾血清过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)活性和总抗氧化能力(T-AOC)均维持在一个较高的水平,且显著高于对照组;4 g/kg组超氧化物歧化酶(SOD)活性与对照组相比显著升高,肝胰腺AKP活性、T-AOC水平均以4 g/kg组最高,显著高于对照组;3g/kg组LZM活性显著高于对照组、1、4、5 g/kg组.结果表明,饲料中添加适量的家蝇抗菌肽可以提高凡纳滨对虾的免疫力和抗白斑综合征病毒的能力.     

抗新城疫病毒中和性单克隆抗体研制和特性分析

应用杂交瘤技术,以纯化的NDV-lasota为免疫原结合间接ELISA筛选到了24株抗NDV单抗,其中3 株(McAb-14、McAb-18和McAb-21)具有中和活性,并与其血凝抑制效价具有很大的相关性。McAb-18和 McAb-21的免疫球蛋白亚类都属于IgG2a;McAb-14为IgG2b。特异性鉴定结果表明:3株抗NDV的单抗均不与马立克病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、减蛋综合征病毒、传染性喉气管炎病毒等发生交叉反应。用这3株中和单抗的任2种混合液对鸡进行了被动免疫治疗和免疫预防试验,结果表明:McAb-14 McAb -18组合的免疫预防和治疗效果最好。     

黄芪多糖对克氏原螯虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的效果研究

研究了基础饲料中添加不同浓度的黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的效果。用添加0%、0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖的基础饲料作为药饵,投喂20 d后,对各组经PCR检测WSSV呈阴性的健康克氏原螯虾进行WSSV病毒悬液腹节背部注射攻毒试验,当添加0%黄芪多糖的阳性对照组中死亡率达到100%时,添加0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖实验组的死亡率分别为(86.67±13.33)%、(91.11±7.70)%、(73.33±17.64)%。为了评价黄芪多糖对克氏原螯虾各器官组织的影响,对其鳃、肝胰腺、心肌组织进行病理组织切片观察,结果发现:添加0%黄芪多糖的阳性对照组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺、心肌组织出现细胞排列无序、细胞破裂、核仁皱缩等明显的病理变化;而添加0.8%黄芪多糖的实验组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺组织未见明显病变,心肌组织核仁出现一定程度的皱缩,但细胞尚未破裂。研究表明:与阳性对照组相比,添加0.8%的黄芪多糖可提高26.67%的存活率,对克氏原螯虾抗WSSV感染有很好的提高效果,可望在生产中收到良好的经济效益。     

蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体研制

用蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）提纯病毒粒子免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,用纯化的ＢＢＷＶ病毒对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经三次有限稀释法克隆,成功获得２株ＢＢ－ＷＶ特异性单克隆抗体的细胞株,分别命名为４Ｄ１１,３Ｇ１２．２株单抗腹水间接ＥＬＩＳＡ效价高达１∶６４００００,抗体类型均为ＩｇＧ１,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ分析表明,２株单抗均是针对ＢＢＷＶ４４．７ｋＤ的外壳蛋白大亚基的特异性抗体．单抗抗原结合位点分析表明４Ｄ１１和３Ｇ１２两单抗作用于同一抗原决定簇     

对虾白斑综合征病毒射阳株的分离及其在螯虾体内的动态分布

从江苏射阳某对虾养殖场采集患白斑综合征的病死对虾，以对虾组织镁浆液接种克氏原螯虾并传至2代。结果螯虾全部发病死亡。用斑点杂交和单抗ELISA检测对虾和2代螯虾，均为白斑综合征病毒（WSSV）阳性，将此WSSV命名为射阳株，进一步用斑点杂交和单抗ELISA检测射阳株在肌注和口服感染螯虾体内的动态分布，并与青岛株的动态分布相比较。口服和肌注螯虾在感染后12h，病毒首先在血淋巴中检出，然后减少，36h后又明显检出，并增加至高峰然后减少；肠上皮、心脏、肌肉中的病毒在口服和肌注感染后36h同时出现并呈总体递增分布；此外，病毒在胃上皮、真皮和结缔组织中也有不同程度的分布。感染死亡螯虾各主要组织器官均可检出病毒；电镜观察死亡螯虾鳃、心脏、肝胰腺、直皮、卵巢等器官的超薄切片，均可见到典型的病毒粒子，显示死亡螯虾内病毒已形成周血感染。WSSV射阳株与青岛株在螯虾的动态分布具有相似性。     

宁波地区南美白对虾白斑综合征病毒（WSSV）的检测与分析

为了解浙江宁波地区南美白对虾白斑综合征病毒（WSSV）的流行情况,为科学防控该病提供参考依据,应用PCR方法对2004～2008年采自宁波地区对虾养殖场的1201份南美白对虾样品进行WSSV检测。结果表明,1201份样品中有364份样品呈阳性,总阳性率为30.31%;2004～2008年的WSSV年平均阳性检出率均较高,且呈不规律变化,其中以2006年南美白对虾白斑综合征发病最严重,阳性感染率达42.66%,但2006～2008年WSSV的年平均阳性检出率呈下降趋势。