三代测序技术及其应用研究进展

通过DNA测序不仅可以更好地认识生命的本质,了解生物的差异性、进化及发展史,而且为重组DNA的研究提供了方向,在疾病诊断及基因分型方面具有非常重要的实用价值。首先从发现DNA是遗传物质开始,简要回顾了第一、二和三代测序技术的整个发展历程,以及各自的优缺点和主要测序技术或平台;其次,重点介绍了由PacBio公司开发的第三代测序典型技术--单分子实时测序技术（SMRT）和ONT纳米孔测序技术的原理、方法和技术流程,并总结了第三代测序技术的应用领域,包括基因组重测序、do novo测序、转录组研究、甲基化检测、与疾病相关的结构变异检测,以及流行病学中病毒准种分析等应用;再次,比较了三代测序技术在转录组测序和表观遗传学研究中的技术优势,第三代测序技术在基因组重复区域或结构变异等研究领域具有非常明显的优势,对多种疾病的研究意义重大,已成为未来重要的精准诊断工具,此外,凭借对重要经济物种遗传信息的解析,育种工作者通过建立基因与性状的关联,对持有优良性状基因的个体进行人工选育,大大缩短了育种年限;最后,对第三代测序技术在医疗、农业、环境等领域的应用前景进行了展望。     

哺乳动物Y染色体的测序进展

哺乳动物的性染色体由一对常染色体演化而来,其中X染色体在物种间相对保守,而Y染色体则存在很大的变异,包括染色体的大小、结构和基因数量等.研究Y染色体的遗传结构与变异,对于理解哺乳动物的起源进化、性别决定以及动物繁殖都具有重要意义.因此,文章综述了哺乳动物Y染色体的结构与变异,以及Sanger测序技术、二代测序技术、三代...     

新疆褐牛核心群母牛蜘蛛腿综合征的遗传检测

以173头新疆褐牛核心群母牛血样为基础,采用荧光引物PCR产物毛细管电泳法结合PCR产物直接测序法检测蜘蛛腿综合征隐性基因。结果显示,荧光引物PCR产物毛细管电泳法检测的173份血样DNA片段均在246～250bp出现单一信号峰。其中,21份PCR产物直接测序未出现牛蜘蛛腿综合征SUOX基因致病突变G碱基插入导致的叠峰现象,序列比对显示测序检测未发现突变的杂合子个体,22种方法检测结果一致。结果表明,2种检测方法所检测的新疆褐牛核心群母牛个体均为纯合基因型,没有发现牛蜘蛛腿综合征SUOX致病等位基因的存在或携带该致病基因的个体,说明该研究群体不存在传播牛蜘蛛腿综合征的风险。     

荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征焦磷酸测序检测方法建立与应用

为建立一种快速高通量的荷斯坦奶牛脊柱畸形综合征（complex vertebral malformation,CVM）的分子检测方法,根据CVM是由于SLC35A3基因第4外显子559位处发生G→T突变的遗传学基础,利用Assay Design SW软件设计了1对PCR引物和1条测序引物对三种不同基因型的基因材料进行测序分析,建立焦磷酸测序检测方法。对55份进境荷斯坦奶牛血样进行检测,发现有1例为隐性基因携带者,将PCR产物进行测序,其DNA序列与焦磷酸测序检测结果一致。研究表明该方法是一种有效的新方法,可用于荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征的检测。     

转录组测序——RNA-Seq技术在动物疾病检测中的应用研究进展

从第二代测序技术发展起来的转录组测序技术(RNA-Seq),具有不受物种限制、更高分辨率、背景噪音低、重复性高、成本低廉等优点;被广泛应用于遗传育种、癌症筛查、病原检测等各个领域。目前在野生动物疾病预防诊断工作中还没有该技术应用的报道。本文从RNA-seq技术在动物病毒病、细菌病、寄生虫病三个方面的应用进展进行了阐述,以期能尽早将该技术应用到野生动物疾病防治工作中,为野生动物预防与抵抗病原体感染提供解决策略。     

施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法的建立

拟建立施马伦贝格病毒(SBV)S基因焦磷酸测序检测方法,用于施马伦贝格病毒病的快速检测和确诊。通过对公开发表的SBVS基因序列与布尼病毒科其他11种病毒S基因进行比对,找出不同病毒变异区域集中且变异区域两侧保守的序列片段,基因合成,体外转录,作为基因扩增模板。在特异性变异序列两端的保守区域设计扩增引物,进行RT-PCR扩增。在保守区域设计双向测序引物,对RT-PCR产物进行双向焦磷酸测序。通过比对测序结果,确定是否为SBV核酸序列;优化条件,确定检测方法的敏感性、特异性和重复性,建立SBVS基因焦磷酸测序检测方法。结果:建立的施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法扩增基因片段长度为166bp;敏感性为可检测到104个拷贝;每一条测序引物可准确测出50bp左右核酸序列,双向测序可准确测出100bp左右核酸序列,具有较好特异性,完全满足施马伦贝格病毒病确诊要求;重复测序3次,均能准确测出100bp左右核酸序列。本研究建立的施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法,可用于施马伦贝格病毒病的检测和确诊,整个检测过程可在1d内完成,大大缩短了确诊时间。     

单分子测序技术在畜禽科学研究中的应用

单分子测序也称为第三代测序，是近年发展起来的新一代测序技术。单分子测序代表性技术主要有PacificBiosciences公司的单分子实时测序和OxfordNanopore公司的单分子纳米孔测序技术。与第一代和第二代测序技术相比，新一代测序技术具有单分子测序、超长读长以及RNA也可直接测序等特点，为科学研究提供了更大的便利。本文概述了单分子测序技术的基本原理和特点，总结了其在畜禽遗传育种、畜禽病原微生物研究、有益微生物开发和畜禽产品检测中的应用现状，以期为单分子测序技术在畜禽科学中更广泛地应用提供参考。     

我国成功研发新一代基因测序仪 达国际设备技术指标

<正>中国自主研发的新一代基因测序仪获得成功,日前在长春首次展示样机。它已达到和部分超越国际主流设备技术指标,填补了中国在该领域的空白。由中国科学院北京基因组研究所与吉林中科紫鑫科技有限公司联合研制的新一代基因测序仪,与国外第二代高通量测序系统相比,成功解决了"读长较短"这一关键技术难题。此外,该仪器成本低于进口设备的三分之一以上,应用成本低于     

高通量测序技术在临床兽医学中的应用研究进展

高通量测序技术因其能够一次同时对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定,是对传统Sanger测序革命性的改变,因此称为下一代或二代测序技术。随着第二代测序技术的迅猛发展,越来越多的学者也开始应用高通量测序技术来解决临床兽医学中的各类问题。文章从高通量测序技术发展现状简介、动物遗传育种与优良品种改进、基因筛选与基因调节机制、动物疾病预防与诊断、兽药筛选等方面对高通量测序技术在临床兽医学中的应用进行综述。     

高通量测序技术及其在生命科学中的应用

Sanger法第1代测序技术给人类破译遗传密码提供了强有力的工具,经过30多年的不断改善,现已发展到以高通量、速度快、低成本为主要特征的第二代测序技术,给生命科学领域带来了革命性的变化。比较了第2代测序方法与Sanger测序方法的差异,并阐述了其在生命科学中的应用。     

纳米孔测序技术在动物疫病防控中的应用

纳米孔测序是基于单分子的第三代基因测序技术,具有便于携带、实时测序、超长读长等技术优势。近年来,纳米孔测序技术发展迅速,在动物疫情现场处置、流行病学调查监测、动物疫病临床快速诊断、病原体基因组学研究等动物疫病防控领域得到广泛应用。通过综述可以发现纳米孔测序具有如下应用方面的特点：可及时准确鉴别病原体,给出精准检测结果,有助于基层有效应对突发、新发、外来动物疫情;可与PCR联合应用,快速获得病原体全基因组序列,为病毒遗传变异和流行病学分析提供重要参考和理论依据;可用其探索建立灵敏可靠、灵活机动、快速反应的病原体监测预警网;可利用其优势建立较全面的病原体基因库,为后续的临床耐药性分析及用药指导提供建议。随着纳米孔测序技术的不断发展,其在测序通量、准确度和自动化程度,测序成本与周期,数据分析软件的丰富性和易用性等方面有望进一步改善。     

纳米孔测序技术在疾病检测中的研究进展

近几年兴起的纳米孔测序技术(nanopore sequencing)为新一代测序技术,又称第三代测序技术,已开始应用于细菌、病毒、抗生素耐药及动物疫病等多个领域的检测.虽然在实际应用中仍存在一些瓶颈,包括测序精度不高、样品制备过程需要优化等,但该技术在疾病检测方面存在明显优势,包括可直接检测碱基修饰,超长读长、高分辨率...     

美洲貂BAC文库的构建及毛皮产业重要候选基因的筛选

BAC文库是基因组分析的有力工具,再结合最新兴起且快速的深度测序技术,从而提供了一个很好的基因组计划的信息平台。本研究介绍了一个产于丹麦的雄性美洲貂CHORI-231BAC文库的构建方法及其特点,该文库包含了165888个克隆,平均插入片段在170kb,代表了约10倍的覆盖度。用一个有18432个克隆位点的高密度过滤器复制两份,用于杂交测序及公共使用。基于Overgo探针的表达序列标记,代表21个与毛皮工业关系密切的特征候选基因,用于BAC文库的筛选,这些候选基因包括了毛色、毛发生长、毛发长度和粗细及一些毛皮病毒疾病的感受器受体等。大规模测序以寻找其中19个相关基因。将获得的与这些基因相关的35个克隆进行高通量测序,并对大的重叠群进行组装。知道这些候选基因的全长序列之后有助于确认表型的位置及揭示目的性状的成因。另外,对1577个克隆进行了末端测序,获得了2505个克隆的末端序列(80%的BAC克隆),对剩余2Mb进行了分析,从而获得了貂皮整个基因组的快照。所构建的CHORI-321美洲貂BAC文库可用于基因和基因组兴趣位点的鉴定。试验描述了如何利用此文库进行特殊位点的鉴定,开发遗传标记,用于BAC末端测序和深度测序以选取克隆。这是首次利用454测序来挑选哺乳动物的克隆,确认了利用此技术获得小基因组目的基因序列信息的可行性。文中所获得的BAC末端测序结果已保存到GenBank数据库(HN339419-HN341884,HN604664-HN604702),从所选取克隆中获得的454序列重叠群的参考编码为(GenBank:JF288166-JF288183&JF310744)。     

测序技术的发展对瘤胃元基因组研究的影响

<正>2005年,454 Life Sciences公司首次开发了第二代测序技术——高通量测序技术,又称"下一代"测序技术,以一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志,同时还可对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌分析,又被称为深度测序[1]。相对于第一代的96道毛细管电泳测序仪,高通量设备具有更高的测序通量,根据各公司的高通量基因测序仪读取长度不同(25 bp到     

基于PacBio三代测序的高质量汶上芦花鸡基因组的组装

【目的】汶上芦花鸡为中国唯一的芦花羽地方鸡品种资源,芦花基因可伴性遗传,芦花羽性状可用于雏鸡的自别雌雄。试验旨在丰富家鸡基因组信息,获取汶上芦花鸡全基因组序列,为鸡伴性芦花羽分子机制研究提供材料。【方法】以汶上芦花鸡为试验动物,基于BGI MGISEQ构建小片段文库进行基因组特征评估,利用PacBio三代测序技术、Hi-C技术组装及构建汶上芦花鸡全基因组信息数据库,利用生物信息学方法对获得的基因组序列进行组装和功能注释。【结果】试验共获得BGI二代测序数据量59.70 Gb;获得PacBio三代测序数据量31.13 Gb, reads平均长度为15 362 bp;获得Hi-C数据量95.37 Gb;拼接和初步组装得到基因组大小为1.12 Gb,经Hi-C辅助组装后,共有1.07 Gb的序列挂载到41条染色体上,挂载率95.62%,基因组contigs N50为9.61 Mb, scaffold N50为91.29 Mb, BUSCO评估为98.50%,基因组连续性和完整度良好;预测基因组有22.57%的重复序列,有426个tRNAs、56个rRNAs、260个miRNAs和308个sn...     

施马伦贝格病焦磷酸测序检测方法的建立

为适应口岸施马伦贝格病快速、准确、高通量检测需求,建立一种基于RT-PCR及焦磷酸测序技术平台的施马伦贝格病检测方法。本研究针对施马伦贝格病毒基因组RNA的S、M和L三个基因节段保守区域利用焦磷酸测序软件PyroMark Q96ID分别设计RT-PCR扩增引物及焦磷酸测序引物,以人工合成的SBV重组质粒为模板分别建立了SBV S、M、L基因的PCR-焦磷酸测序检测方法,比较三基因的PCR扩增结果以及测序分析结果,结合特异性检测结果,最终确定以M基因作为靶基因建立的焦磷酸测序检测方法效果最好,并以德国FLI提供的SBV（BH80株）RNA对所建立的方法进行验证,通过对测得序列的比对分析可确定为施马伦贝格病毒,这表明本研究所建立的方法灵敏度高、稳定性好、特异性强,可以用于施马伦贝格病毒基因序列水平上的精准检测鉴定。     

PCR-SSCP技术的研究进展

基因单核苷酸多态性 (ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒ ｐｈｉｓｍ ,ＳＮＰ)是指基因组中单个核苷酸变异引起的ＤＮＡ序列多态性 ,包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式 ,它是继第一代作图用分子标记 -ＲＦＬＰ、第二代作图用分子标记 -微卫星标记之后的第三代作图用分子标记 ,也是目前广泛应用于分析分子种群生物学特征、遗传性疾病检测及特定功能基因或片段的分型等。用于检测ＳＮＰ的方法较多 ,包括直接测序 (Ｄｉ ｒｅｃｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ)、以构象为基础的方法 (Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ -ｂａｓｅｄｔｅｃ…     

斑马鱼1号染色体全基因首次敲除

正10月10日,斑马鱼1号染色体全基因敲除计划结题会暨第二届全国斑马鱼PI大会开幕式在湖北省武汉市召开。会上科学家们宣布,中国科学家基本敲除了斑马鱼1号染色体上的1333个基因,这也是世界上科学家首次完成斑马鱼1号染色体全基因敲除计划,为研究人类疾病演化及治疗奠下科学基石。据介绍,斑马鱼因全身布满多条蓝色条纹似     

荷斯坦牛瓜氨酸血症焦磷酸测序检测方法的建立与应用

为建立一种快速高通量的荷斯坦牛瓜氨酸血症(Citrullinemia,CN)分子检测方法,依据CN是由于精氨酸琥珀酸(ASS)合成酶基因编码第86位精氨酸的密码子突变为终止密码子的遗传学基础,利用Assay Design SW软件设计了1对引物和1条测序引物对三种不同基因型的基因材料进行测序分析。用建立的方法对55份进境荷斯坦牛血样进行检测,发现有1例为隐性基因携带者,将PCR产物进行常规测序,结果与焦磷酸测序检测结果一致。研究表明该方法可用于荷斯坦牛瓜氨酸血症的检测,是一种有效的新方法。     

三代测序技术及其应用研究进展

通过DNA测序不仅可以更好地认识生命的本质,了解生物的差异性、进化及发展史,而且为重组DNA的研究提供了方向,在疾病诊断及基因分型方面具有非常重要的实用价值。首先从发现DNA是遗传物质开始,简要回顾了第一、二和三代测序技术的整个发展历程,以及各自的优缺点和主要测序技术或平台;其次,重点介绍了由PacBio公司开发的第三代测序典型技术——单分子实时测序技术(SMRT)和ONT纳米孔测序技术的原理、方法和技术流程,并总结了第三代测序技术的应用领域,包括基因组重测序、do novo测序、转录组研究、甲基化检测、与疾病相关的结构变异检测,以及流行病学中病毒准种分析等应用;再次,比较了三代测序技术在转录组测序和表观遗传学研究中的技术优势,第三代测序技术在基因组重复区域或结构变异等研究领域具有非常明显的优势,对多种疾病的研究意义重大,已成为未来重要的精准诊断工具,此外,凭借对重要经济物种遗传信息的解析,育种工作者通过建立基因与性状的关联,对持有优良性状基因的个体进行人工选育,大大缩短了育种年限;最后,对第三代测序技术在医疗、农业、环境等领域的应用前景进行了展望。