奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼SRY基因同源克隆和序列分析

采用人SRY基因保守序列的特异性引物，对奥利亚罗非鱼（Orcocbromis aureus）和尼罗罗非鱼（O．nilotica）雌、雄个体基因组进行PCR扩增，回收其中的600bp片段，分离克隆并双向测序。用DNAStar分析比较所得序列，表明克隆的600bp片段为SRY基因的同源序列。对两种罗非鱼雌、雄个体SRY同源序列进行多序列比较分析（CLUSTAL W分析），表明罗非鱼间SRY同源序列的相似性非常高，但仍存在性别间、种间差异。奥利亚罗非鱼雌、雄间序列相似性为99．5％，尼罗罗非鱼雌、雄间为99．5％，奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼种间则为98．7％，罗非鱼与人类SRY基因间只有7．1％，结果为进一步研究罗非鱼SRY同源基因与性别决定的关系提供了可能性。根据这些结果构建了罗非鱼系统分类树，表明奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼具有很近的亲缘关系。     

奥利亚罗非鱼3种C型溶菌酶基因的克隆及其序列分析

本研究结合RT-PCR和RACE法获得了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)三种C型溶菌酶基因C-1,-2和C-3的全长cDNA.3个基因的cDNA分别为581 bp、662 bp和695 bp,各编码143、156和143个氨基酸(GenBank accession No:EU913095,EU913094和EU836689),相互间氨基酸序列的同源性在63.9%~67.8%之间.3个基因均具有与其它物种C型溶菌酶相同的8个保守半胱氨酸残基和2个活性位点Glu~(35)和Asp~(52),可认为它们均为C型溶菌酶基因.在系统进化树中这3个基因首先与同属高等真骨鱼类的聚类,最后再与低等真骨鱼类的聚类,系统进化关系与传统鱼类分类地位相吻合,显示真骨鱼类C型溶菌酶的进化速度与物种的进化速度基本一致.蛋白分析软件分析显示这3个基因均具有C型溶菌酶的典型结构、相似的蛋白二、三级结构,推测应具有与C型溶菌酶相似的生理功能.但3个基因氨基酸序列间存在一定差异,其中C-1的等电点较低且碱性氨基酸较少,因此3种溶菌酶可能具有生理功能上的差异与分工.     

尼罗罗非鱼β2m基因的克隆、多态性分析及组织表达特征

β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)是主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ分子的亚基之一,与MHC-Ioα链非共价结合构成MHC Ⅰ分子.本实验通过反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)克隆了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus) β2m基因的全长cDNA序列及基因组序列,并对cDNA多态性、mRNA组织分布及感染链球菌后表达的变化进行了分析.结果共获得尼罗罗非鱼2条β2m基因cDNA,全长分别为900和906 bp.两cDNA均包括351 bp的ORF,共编码116个氨基酸残基,还包含68 bp的5'非编码区(5'-UTR)和486(492) bp的3'-UTR.两条cDNA对应各自不同的基因组序列.基因组序列分析发现,β2m基因含3个外显子和2个内含子.尼罗罗非鱼β2m基因推测氨基酸序列与其他物种的β2m基因相似性在39.20％～89.80％之间.β2m基因cDNA多态性分析表明,尼罗罗非鱼中共有2种不同类型的β2m cDNA,每种类型cDNA又有3种不同的亚型.定量PCR分析表明,β2m基因在尼罗罗非鱼脾脏、心脏和肾脏中表达量最高,鳃与肠中的表达量较高,在皮肤和肌肉中的表达量最低.腹腔注射无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后,尼罗罗非鱼β2mmRNA表达量在4个所检测组织(鳃,肾脏,心脏和脾脏)中均出现了先上升后下降的变化趋势.本实验结果表明,β2m基因可能参与尼罗罗非鱼的免疫应答,在免疫反应中发挥重要功能.本研究有助于进一步了解尼罗罗非鱼的免疫调节机制和更好地理解鱼β2类m的生理功能.     

油菜花发育同源异型基因BAP2的克隆及序列分析

拟南芥(Arapidopsis)同源异型基因AP2对花分生组织和花器官的发育具有重要的表达调控作用。根据AP2基因信息利用同源序列法分离了油菜(Brassicarapa)的AP2基因(BAP2,GenBank登陆号:AF941097),并且比较了正常油菜与无花瓣油菜BAP2基因序列的差异。研究结果表明,BAP2基因的DNA序列长度为2138bp,包含9个内含子,外显子区与AP2基因的同源性达90%以上;推导的氨基酸序列为433aa,具有完整的核定位信号区和高度保守的AP2结构域,推测与AP2基因具有相似的功能。正常油菜和无花瓣油菜的BAP2基因序列仅有2处碱基存在差异,这2处碱基均位于内含子区,推导的氨基酸序列则完全一致,因此初步认为白菜型油菜花瓣缺失突变与BAP2基因无关。     

基于STK激酶保守结构域克隆香蕉R基因和RLKs同源序列*

利用抗病候选基因（Candidate resistant gene analogs,RGAs）克隆法是获得香蕉RGAs的一条简捷而有效的途径,该法已从14种植物中获得了RGAs,发现的大多数R基因都是受体样蛋白激酶（receptor-like protein kinase,RLKs）,并具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase,STK）结构域（Feuillet et al.,2001,）.本研究利用STK类R基因的STK蛋白激酶保守结构域合成简并引物,扩增香蕉主栽品巴西香蕉基因组DNA,获得RGAs同源序列和STK蛋白激酶家族基因同源序列,对于研究香蕉STK类R基因的起源和进化,利用分子标记辅助育种以及香蕉抗病信号传导机制研究和R基因的克隆将提供重要的背景.     

黄瓜生长素受体同源基因的克隆、序列特征及表达模式分析

为了解生长素受体及其信号通路在黄瓜(Cucumis sativus L.)中的调控机制和生物学功能,寻找提高产量的新途径并指导农业生产,我们以拟南芥(Aabidopsis)生长素受体家族AtTIR1/AFBs基因序列为参照进行比对,从黄瓜全基因组数据库中筛选出2条具有很高同源性的基因序列,分别命名为Cs TIR和CsAFB.克隆和测定了这2个基因的cDNA序列,构建了过表达载体,拟在黄瓜中开展反向遗传学研究.基因序列提交至GenBank并得到收录,其中CsTIR的登录号KC414935.1,CsAFB登录号KC414934.1.采用生物信息学方法对CsTIR和CsAFB蛋白的基本理化性质、功能结构域进行初步预测,对其在物种间的保守性进行进化分析,推测它们可能是黄瓜的生长素受体.采用semi-q RT-PCR分析了这两个基因的时空表达模式,发现10d黄瓜幼苗中CsAFB基因的表达量在根和叶中比在茎中高,CsTIR基因在茎中几乎检测不到表达;70d成年黄瓜各组织都有CsTIR和CsAFB表达,无明显组织特异性.本研究为寻找黄瓜生长素受体提供了实验依据,为进一步研究生长素信号通路在黄瓜中的功能及调控机理提供了基础资料.     

几种菊科植物BADH基因同源片段的克隆与序列分析

利用PCR-Southern的方法对菊科26个种和2个菊花（Dendranthema × grandiflora ）栽培品种的甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）基因进行了检测,其中18个种和2个栽培品种呈现明显的阳性信号。对其中7个种和1个栽培品种的PCR产物进行了测序（GenBank登录号：EF683587- 683595）,其中旋覆花中获得两个长度差异较大的序列。序列分析表明：在被克隆的基因片段中,外显子的长度在各种间是一致的,且同源性在83%以上,推测的氨基酸序列的同源性在90%以上,其中旋覆花长片段中保守十肽的第二个氨基酸由苏氨酸变异为丙氨酸。各序列内含子的长度差异较大,泽兰（Eupatorium lindleyanum）、祁州漏芦（Stemmacantha uniflora）、旋覆花（Inula japonica）长片段的内含子之间,及与其它序列的内含子之间均无明显的同源性,而其它序列的内含子间则表现出较高的同源性,且由内含子所反映的基因间的系统关系与外显子反映的系统关系基本一致。     

尼罗罗非鱼胰岛的显微和亚显微结构

应用光镜、电镜及特殊染色等技术对尼罗罗非鱼(Tilapia nilotica)的胰岛及其细胞类型和形态进行了详细的研究。尼罗罗非鱼的胰脏与肝脏混合存在，属于肝胰脏。胰岛散布在胰腺内，无固定的形态，胰岛细胞的数量与类型因胰岛的大小而异。用Gomori醛复红特殊染色法，见尼罗罗非鱼胰岛有三种细胞：A细胞胞质中有黄色颗粒；B细胞胞质中有紫红色的颗粒；D细胞胞质内有浅绿色或淡灰色的颗粒。电镜下，B细胞的分泌颗粒较大,芯的形态多样，电子密度差异大,芯与界膜之间常有较大的间隙；A细胞分泌颗粒形态不规则，芯的大小不等，界膜与芯之间无间隙；D细胞分泌颗粒较多，芯的电子密度较低，界膜与芯之间无间隙。此外，胞质内可见较大的线粒体。     

棉花叶绿体ndhB基因的克隆和序列分析

叶绿体ｎｄｈＢ基因编码ＮＡＤＨ脱氢酶ＮＤ２亚基。本研究应用ＰＣＲ技术，从棉花叶绿体基因组中扩增并克隆了长度为２．１ｋｂ片段，该片段含有棉花叶绿体ｎｄｈＢ基因。采用外发酶Ⅲ定向缺失和限制性内切酶消化的策略构建亚克隆，并测定了该片段的全部核苷酸序列。     

黑籽南瓜中NBS类抗病基因同源序列的克隆与表达分析

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的对病害有较强抗性的一种瓜类作物。为发掘利用其蕴含的优异抗病基因资源,本研究根据已克隆到的植物核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)类抗病基因的保守氨基酸结构域基因设计简并引物,通过PCR扩增从黑籽南瓜基因组中分离了8条黑籽南瓜抗病基因同源序列(resistance gene analogous,RGAs),聚类分析和相似性比较结果显示,黑籽南瓜抗病基因同源序列2(black seed squash resistance gene analogous 2,HQRGA2(Gen Bank No.:MG946756)单独为一类,且具有核苷酸结合衔接子(nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1,R proteins and CED-4;NBARC)结构,其余7条序列均不具有NBS保守结构域。核苷酸相似性分析表明,HQRGA2与部分抗病基因序列的相似性达到87%~99%,其中与南瓜(Cucurbita maschata)NBS类抗病蛋白基因13(squash resistance gene analogous,SQRGA-13)和SQRGA-8的相似性分别达到98.0%和97.0%。对HQRGA2编码的氨基酸保守结构域分析表明,其含有NBS类抗病基因的4个保守模块:P-loop、Kinase-2、Kinase-3a和GLPL区,且属于无Toll蛋白或白介素1受体类似的NBS富亮氨酸重复(non toll/interleukin-1 receptor like of NBS plus leucine-rich region,non-TIR-NBS-LRR)类抗病基因同源序列。HQRGA2编码氨基酸的同源性分析结果表明,其与南瓜抗病蛋白基因SQRGA-13氨基酸同源性较高,达到96.6%,与其余抗病基因同源性在16.6%~43.8%之间,NBS区域氨基酸系统进化树分析结果表明,HQRGA2可能是一个新的抗病基因片段。q RTPCR分析表明,黑籽南瓜HQRGA2片段的表达受尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的胁迫诱导,表现出先扬后抑的表达模式,说明HQRGA2可能为抗病相关基因片段。黑籽南瓜中NBS类抗病基因同源序列HQRGA2的获得为分离克隆其完整抗病基因提供了新线索。     

芸薹属植物非编码RNA BcMF11基因同源序列的克隆及进化分析

芸薹属植物资源丰富,具有重要的经济价值,但其亲缘进化关系较复杂.非编码RNA是一类在生物体内广泛存在的,没有明确的开放阅读框,但能够在生活活动中行使多种调节功能的特殊基因(Storz,2002).     

小麦RPL21基因同源克隆与表达分析

为了解60S核糖体蛋白L21(ribosomal protein L21,RPL21)的基因组结构和表达模式,以GenBank数据库中小麦RPL21基因的部分序列为信息探针,采用RT-PCR和PCR技术从小麦多子房株系幼穗中克隆了RPL21基因的cDNA与DNA片段,并对该基因在小麦多子房近等基因系间的表达差异和多子房...     

小麦膨胀素基因TaEXPB8部分同源cDNA序列的克隆、定位及表达分析

膨胀素（expansin）是植物生长发育过程中诱导细胞壁松弛和伸展的重要蛋白。分别采用RACE方法,克隆了小麦（Triticum aestivum）TaEXPB8的4个部分同源基因的全长cDNA,其长度分别为1180、1169、1150和1135bp,依次命名为TaEXPB8-1、TaEXPB8-2、TaEXPB8-3和TaEXPB8-4。研究发现,这些基因的启动子区域均含有预测的生长素顺式作用元件。定位结果显示,TaEXPB8-1的位置无法确定,TaEXPB8-2和TaEXPB8-3定位到同一染色体上的相邻区域,即Bin6AS（0.35～1.00）区域,TaEXPB8-4位于Bin6DS（0.99～1.00）区域。在水稻（Oryza.sativa L.）、玉米（Zeamays L.）和拟南芥（Arabidopsis）基因组的同线性区域也存在膨胀素基因的串联重复,说明TaEXPB8-2和TaEXPB8-3可能为同一基因的两个拷贝,并在双子叶和单子叶植物分化之前已经形成。表达分析结果表明,TaEXPB8基因在小麦初生根的伸长区表达丰度最高,且受外源高浓度生长素处理的抑制,推测其可能在小麦根中起重要作用。     

粉菠萝FVE同源基因的克隆及表达分析

FWE是植物自主开花途径中的关键基因,主要通过抑制FLC的表达来调控花发育过程。本研究利用粉菠萝似echmeafasciata）茎尖组织转录组序列数据,通过RACE技术克隆获得了粉菠萝中n,E同源基因A毋yE的cDNA全长序列。该序列全长为1672bp,开放阅读框为1404bp,编码由468个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白序列中含有6个保守的WD重复区域。氨基酸序列比对结果表明,4椰E基因编码的氨基酸序列与其它物种中WE的同源序列具有较高的相似性。qRT—PCR（实时荧光定量PCR）分析结果显示,粉菠萝中A椰E基因对外源乙烯的刺激产生了应答。在采用乙烯利灌心处理不同时间的过程中,发现A删E基因的转录水平均在处理后1d时达到最大,推测A椰E可能参与乙烯信号反应,该基因在粉菠萝自主开花途径中的调节作用可能受乙烯影响。     

十字花科植物CYP86MF同源基因的克隆及特征分析

用保守的特异引物进行PCR扩增，并结合RACE技术，从大白菜(Brassicacampestris L．)品种黄芽14，萝卜(Raphanus sativus L．)品种圆白和诸葛菜(Orychophrogmus violaceus)3个材料中扩增到3个完整的cDNA全长，分别命名为Bc-CYP86MF，RsCYP86MF和OvCYP86MF，它们的cDNA全长分别为1854，1818和1876bp，分别编码524，526和534个氨基酸残基。将所推导的氨基酸序列与数据库中已知基因进行排序，发现它们与拟南芥CYP86家族所有成员的氨基酸相似性都大于38％，可将它们归为细胞色素CYP86基因家族。BcCYP86MF和RsCYP86MF与CYP86C4亚家族氨基酸同源性均大于55％，则可归为CYP86C4亚家族，而OvCYP86MF与CYP86C3的同源性最高，为86．5％，应归为CYP86C3亚家族。根据氨基酸序列的排序结果构建的系统树表明，CYP450基因的氨基酸序列进化程度与物种的亲缘关系的远近相吻合。对蛋白二级结构预测结果发现，它们都具有细胞色素P450典型的保守结构域FNAGPRLCIG，而且氨基酸组成也很相似。     

白沙蒿肌动蛋白基因核心片段的克隆和序列分析

本研究以荒漠植物白沙蒿总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增出肌动蛋白基因核心序列。将获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析表明：白沙蒿肌动蛋白基因核心片段长599bp,编码198个氨基酸。将该序列在GenBank中注册,并与多种植物肌动蛋白序列进行同源性比较,发现该片段的核酸序列同源性在75％以上,氨基酸序列同源性在85％以上,具有高度保守性。     

尼罗罗非鱼、莫桑比克罗非鱼和福寿鱼中某些组织乳酸脱氢酶及其同工酶的研究

本文用紫外分光光度法、薄层聚丙烯酰胺等电聚焦法及薄层浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定尼罗罗非鱼、莫桑比克罗非鱼、福寿鱼的心、肌、肝三种组织中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase简称LDH)的总活力及其同工酶的等电点和分子量。结果表明:三种鱼的三种组织乳酸脱氢酶总活力顺序为心>肌>肝;在同一组织中其活力顺序为福寿鱼>尼罗罗非鱼>莫桑比克罗非鱼。其同工酶等电点(PI)为:心PI5.85～7.5,肌PI5.95～8.2,肝P15.6～8.55。三种组织酶谱带分子量在232000～680000之间。此法可为鱼类选育种、分类和定种提供生化参数。     

一个与拟南芥RNA病毒寄主因子同源的水稻基因OsTOM3的克隆与序列分析

从水稻品种桂99中克隆了参与烟草花叶病毒的复制的拟南芥A tTOM 3的同源基因O sTOM 3。该基因全长cDNA共有1 3 0 0个核苷酸,包含一个含8 8 5个核苷酸的编码区、1 7 7个核苷酸的5′非编码区和239个核苷酸的3′非编码区,编码一个含294个氨基酸的蛋白质,分子质量为34.0 ku,等电点为9.51。O sTOM 3的氨基酸序列包含多个高疏水性区域,推测是一种8次跨膜蛋白。O sTOM 3与A tTOM 3的同源性为74.9%。用PCR的方法克隆了O sTOM 3基因的全长转录区,共3 885 bp,包含11个外显子和10个内含子。