草莓镶脉病毒外壳蛋白抗原表位预测、克隆、表达及鉴定

为实现草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的简单和快速检测,应用生物信息学方法分析了SVBV外壳蛋白的线性抗原表位及其理化性质,以大肠杆菌的优势密码子对所预测的优势抗表原位进行设计并合成,同时进行了最佳异源表达条件优化。结果表明,第218~238位的氨基酸残基序列为SVBV外壳蛋白的优势抗原表位,其编码片段为5-AE。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测结果表明,重组融合蛋白的分子量约为24.8 kD,与其理论分子量20.5 kD基本一致。异源表达优化的结果表明,当IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度为40℃、诱导时间为4 h时,重组融合蛋白的表达量最高,为23.6 mg/L。Western blot结果表明重组融合蛋白能与His多克隆抗体起特异性反应。串联质谱结果表明,5-AE肽段氨基酸残基序列正确。     

草莓镶脉病毒侵染性克隆的构建

 利用草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)全长克隆pSVBV-E3构建SVBV侵染性克隆。pSVBV-E3经限制性内切酶酶切分别获得0.5-mer SVBV和1.0-mer SVBV,依次正向插入植物表达载体pBINPLUS,成功构建侵染性克隆重组质粒pBIN-1.5SVBV。pBIN-1.5SVBV转化农杆菌,分别接种森林草莓(Fragaria vesca)和4种烟草属植物(Nico-tiana spp.)验证其侵染性。结果表明,SVBV侵染性克隆接种森林草莓8周后发病,表现出典型的叶脉镶边黄化症状,PCR法可以从显症森林草莓中检测出SVBV cp基因,Southern blot法可以检测出SVBV基因组。而接种4种烟草属植物8周后未观察到发病症状,PCR法也未检测出SVBV cp基因。构建的SVBV侵染性克隆经接种验证能够侵染森林草莓,为进一步研究SVBV侵染森林草莓的致病机制奠定了基础。     

草莓镶脉病毒ORF Ⅵ基因的原核表达与抗血清制备

为了分析草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）ORF Ⅵ基因的功能,采用原核表达技术获得该基因表达的重组蛋白并制备其抗血清。利用PCR技术扩增得到SVBV中国分离物的ORF Ⅵ基因,将此基因克隆到原核表达载体pET-SUMO上,获得重组质粒pET-SUMO-ORF Ⅵ。转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导与Ni²⁺-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为90 kD的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清,采用间接ELISA和Western blot方法测定抗血清的效价、反应灵敏度以及ORF Ⅵ基因在本氏烟中的瞬时表达。结果显示,间接ELISA法测定抗血清对重组蛋白的效价达1：256 000,Western blot法能够检测到稀释64 000倍的重组蛋白。利用稀释2 000倍的抗血清,仍能够检测出SVBV中国分离物和美国分离物ORF Ⅵ基因在本氏烟中瞬时表达的蛋白。     

草莓镶脉病毒ORF Ⅱ基因的克隆、原核表达与抗血清制备

 用CTAB法从感染草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus, SVBV）的草莓叶片中提取总DNA,设计特异性引物扩增SVBV中国分离物ORF Ⅱ基因,克隆并测序。结果表明,SVBV中国分离物ORF Ⅱ基因全长486 nts,编码161个氨基酸。将其与SVBV美国分离物以及花椰菜花叶病毒属其他成员的ORF Ⅱ基因相比较,结果表明,SVBV中国分离物 ORF Ⅱ基因与SVBV美国分离物的核苷酸序列相似性最高,达91.2%。将SVBV ORF Ⅱ基因插入原核表达载体pET32a（+）,重组质粒pET-ORF Ⅱ转化大肠杆菌BL21（DE3）。经IPTG诱导及Ni²⁺-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为38 kDa的融合蛋白。以此纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔,可以制备出高效价的抗血清。Western blot分析表明,制备的抗血清能与重组融合蛋白发生特异性反应。利用抗血清进行ELISA测定,能够检测出感病草莓植株病汁液中SVBV ORF Ⅱ基因表达的蛋白。     

利用酵母双杂交系统筛选与草莓镶脉病毒移动蛋白P1互作的寄主因子

 构建感染草莓镶脉病毒(SVBV)森林草莓的酵母cDNA文库,利用酵母双杂交系统,筛选出与SVBV P1蛋白互作的15种寄主因子。生物信息学分析发现,这15种寄主因子参与茉莉酸途径、泛素化、光合作用、抗病抗逆、蛋白修饰、蛋白运输和氧化还原等多种生物过程。另外,这些寄主因子还具有其他分子功能,包括氧化还原酶活性、蛋白二硫化物异构酶活性和金属离子结合活性等。本研究初步探讨了P1与寄主因子的互作机理,为揭示SVBV侵染森林草莓以及SVBV在寄主中扩展的分子机制提供理论依据。     

我国草莓主栽区病毒种类的鉴定

 病毒种类鉴定结果表明我国草莓主要栽培区存在草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓镶脉病毒和草莓皱缩病毒。四种病毒的总侵染株率达80.2%,其中单种病毒侵染株率为41.6%,两种或两种以上病毒复合侵染株率为38.6%。前三种病毒均为球状病毒,粒体直径分别为25-30nm、23nm和50nm;皱缩病毒为杆状病毒,大小为380×70nm。传染性试验的结果证实,草莓病毒可通过嫁接、菟丝子传染,但不能通过机械传染。桃蚜可传染斑驳病毒和轻型黄边病毒,其传毒关系前者为非持久性后者为持久性。田间桃蚜蚜虫口密度高峰期与草莓病毒侵染盛期相吻合。     

我国草莓斑驳病毒研究鉴定

 作者采集6省13市病样73株。经鉴定带SMoV的67株,占样本的91.78%。采取指示植物小叶嫁接法及蚜虫分离和传播病毒试验,并辅以病毒提纯,人工摩擦接种草本植物,病毒粒子电镜及超薄切片观察等手段加以确证。在辽宁省田间获得一种草莓中瘤钉毛蚜(Chaetosiphon sp.)以及棉蚜和桃蚜均传播本病毒,传播率依次为70%,40%及33%(最高率),系半持久性传播。病毒提纯制荆最大吸收值在260nm处,最小吸收值在240nm处。A260/280=1.21。电镜观测病毒粒子为球形,直径28~30nm,病叶超薄切片观察,在细胞质里有晶状球形颗粒,直径约25nm,排列整齐。以分离物(M-3)提纯制剂为抗原所制备的抗血清与有关病样呈阳性反应。试验证实了国内SMoV的发生和分布。     

介体传播的草莓病毒研究进展

草莓病毒在世界各草莓栽培区广泛分布,可随无性繁殖材料和传毒介体传播扩散,严重影响草莓的产量和品质。目前已知传播草莓病毒的介体主要有蚜虫、蓟马、粉虱、线虫和真菌等,总共可传播19种病毒,其中2个为病毒暂定种。本文综述了不同介体传播的草莓病毒的分类地位、分子生物学和生物学特性等方面的研究进展,同时总结并展望了介体传播草莓病毒的检测技术和防治方法的新策略。     

利用多重RT-PCR技术检测草莓病毒的研究

 目前已报道侵染草莓的病毒有20多种,其中草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus, SMoV)、草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus, SMYEV)和草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)是分布较广、危害较重的3种主要病毒。     

云南三七病毒病的发生及病毒种类检测

 对云南省文山市、昆明市、红河州、曲靖市的三七主要种植区进行病毒病调查及相关病毒检测,发现病毒病在上述地区均有发生,年平均发病率均在5%以上,且种植年限越长发病率越高,已成为三七上仅次于根腐病的主要病害。三七病毒病症状类型复杂多样,主要有白化、黄化、褪绿、斑驳、皱缩、卷叶和坏死等。利用PCR/RT-PCR对2011年~2015年,以及2017年采集的466份疑似病毒病样品进行检测,发现侵染三七的病毒主要有三七Y病毒(Panax virus Y,PnVY)、中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)及其卫星(tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB)、三七A病毒(Panax notoginseng virus A,PnVA)和烟草扭脉病毒(tobacco vein distorting virus,TVDV),基中PnVY为当前为害云南三七的优势病毒,TVDV在三七上侵染为害系黄症病毒科成员侵染人参属植物的首次报道。PnVY、TYLCCNV、PnVA和TVDV的平均检出率分别为51.5%、31.9%、10.7%和7.0%,存在PnVY + TYLCCNV、PnVY + PnVA以及PnVA + TVDV复合侵染的现象,复合侵染的检出率分别为20.6%、3.4%和0.3%。未检测到番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt tospovirus,TSWV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒、毛形病毒属(Crinivirus)病毒,以及菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)中除TYLCCNV以外的其他病毒。     

云南三七病毒病的发生及病毒种类检测

 对云南省文山市、昆明市、红河州、曲靖市的三七主要种植区进行病毒病调查及相关病毒检测,发现病毒病在上述地区均有发生,年平均发病率均在5%以上,且种植年限越长发病率越高,已成为三七上仅次于根腐病的主要病害。三七病毒病症状类型复杂多样,主要有白化、黄化、褪绿、斑驳、皱缩、卷叶和坏死等。利用PCR/RT-PCR对2011年~2015年,以及2017年采集的466份疑似病毒病样品进行检测,发现侵染三七的病毒主要有三七Y病毒(Panax virus Y,PnVY)、中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)及其卫星(tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB)、三七A病毒(Panax notoginseng virus A,PnVA)和烟草扭脉病毒(tobacco vein distorting virus,TVDV),基中PnVY为当前为害云南三七的优势病毒,TVDV在三七上侵染为害系黄症病毒科成员侵染人参属植物的首次报道。PnVY、TYLCCNV、PnVA和TVDV的平均检出率分别为51.5%、31.9%、10.7%和7.0%,存在PnVY + TYLCCNV、PnVY + PnVA以及PnVA + TVDV复合侵染的现象,复合侵染的检出率分别为20.6%、3.4%和0.3%。未检测到番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt tospovirus,TSWV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒、毛形病毒属(Crinivirus)病毒,以及菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)中除TYLCCNV以外的其他病毒。     

草莓伪轻型黄边病毒的鉴定

 从6省13市约18品种草莓样本、分离纯化并研究鉴定,初步证实辽宁、哈尔滨及南京一些栽培田,有草莓伪轻型黄边病毒(SPMYEV)的发生分布。在春香、宝交早生、丹东鸡心,诺宾卡及80-3.1等品种上发病。病样先以小叶嫁接技术,接于草莓UC-4、EMC及"Alpine",约3~5周显症、下部叶片呈现黄色斑块,接UC-5、EMB不太敏感仅于老叶上现轻斑驳或褪绿斑,一种草莓中瘤钉毛蚜(Chaetosiphon sp.)及棉蚜(Aphis gossypii)作半持久性传播本病毒,桃蚜(Myzus persicae)不传播。UC-4对本病毒的繁殖、保存和嫁接鉴别最为适合,提纯病毒电镜观察其粒子线状,大小约630~680×12~13nm,县典型核蛋白吸收光谱,其最大吸收值位于2.63nm处;最小吸收值位于243nm处。A260/280=1.24。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,测其外壳蛋白分子量约为37,000d。病叶制做超薄切片也观察到线形晶状病毒粒子,分散或聚集于寄主的薄壁组织细胞质中。本病毒系国内首报。     

河南省草莓病毒病病原的鉴定及5种草莓病毒多重PCR体系的建立

草莓是一种经济价值较高的园艺植物,已在世界各地广泛种植,由于草莓栽培主要依靠匍匐茎及分株进行无性繁殖,很容易感染由多种病毒引起的草莓衰退病。已报道的侵染草莓的病毒种类大约有30种,如草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)、草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)和草毒皱缩病毒(strawberry crinkle virus,SCV)等(Tzanetakis et al.,2010),其中大多数仅在局部地区发生(尚巧霞,2015),关于河南省引起草莓病毒病的病原尚未见相关报道。本研究采集河南省不同地区的草莓病样,鉴定引起草莓病毒病的病原,并针对检测到的病毒建立多重PCR检测体系,以期为河南省草莓病毒病的病原鉴定及其快速检测奠定基础。     

小RNA深度测序鉴定昭通市烟草脉斑病病毒

烟草脉斑病在云南昭通市的烟草上发生危害严重,为明确昭通市烟草脉斑病的病毒种类,本研究采集昭通市的4个烟草种植区症状表现为疑似烟草脉斑病的烟草样品,采用小RNA深度测序技术对不同来源的混合样品进行小RNA测序分析。结果显示混合样品中的病毒分别属于烟草花叶病毒属Tobamovirus、马铃薯Y病毒属Potyvirus和马铃薯卷叶病毒属Polerovirus。根据不同病毒属设计通用引物,分别对不同地区的烟草样品进行RT-PCR验证,结果表明,烟草样品中病毒种类有烟草花叶病毒、烟草脉带花叶病毒、烟草脉扭病毒和马铃薯Y病毒的PVYN、PVYN-Wi和PVYNTN株系。     

百日草花叶病发生调查及其病毒的分离鉴定

百日草花叶病发生调查及其病毒的分离鉴定韦石泉，吴元华，种焱，韩桂珍（沈阳农业大学植保系植物病毒病研究室１１０１６１）沈阳一些花圃菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）百日草（ＺｉｎｎｉａｅｌｅｇａｎｓＪａｑ．）花叶病发生较普遍。在幼苗期即已隐约表现轻微的斑驳、...     

西番莲死顶病病原病毒鉴定初报

从福建省热带作物研究所种植的台农1号杂交种西番莲 Passiflora edulis X.P.edulis var.flavicarpa 采集到表现死顶病状的一个病毒分离物,经苋色藜Chenopodium amaranticolor 5次单枯斑分离,回接紫果西番莲 P.edulis、杂交种西番莲 P.edulis X.P.edulis var.flavicarpa 仍然表现死顶病状。我们对该分离物进行了     

浙江南部柑桔碎叶病的调查和鉴定

 柑桔碎叶病是一种病毒病害。由于它对枳和枳橙砧的柑桔树的破坏性,正愈来愈受到人们的重视。     

温州柑桔裂皮病初步调查和鉴定

柑桔裂皮病(Exocortis)是由一种类病毒引起的危险性病害。目前在我国的四川、湖南、广东、广西、福建、台湾等省已有发生。1977年在浙江海宁从阿尔巴尼亚引入的甜橙上发现过裂皮病。温州是浙江的重要柑桔产区之一,60年代以来通过各种渠道从四川、湖南等地引入不少新品种。为了保护柑桔生产,免受裂皮病危害,以及防止该病害的传播,我们在近两年对温州主要柑桔产区进行田间调查和鉴定,现将初步调查和鉴定结果报道如下。     

玉米疯顶病传播途径的试验及调查

通过病残体土壤接种、病株结实种子传病试验及对严重发病连作田和制种田的玉米疯顶病病情调查表明，玉米疯顶病是由种子传病，病残体不能传病，病株率与种子被害程度及部位呈正相关，重病连作田病情虽有逐年减轻趋势，但病株率仍高于大田种植的４．８倍