家蚕血细胞在体外培养过程中的变化

为建立家蚕血细胞系,以家蚕血淋巴为材料,对其进行了长达1年多的原代培养,并从形态学上进行了观察与分类。详细记录了培养过程中出现的多种细胞或组织的分化或转分化现象,发现有2种家蚕血细胞在体外培养条件下有一定的增殖能力,暗示家蚕血细胞体外建系具有可行性。     

t10,c12-CLA对猪皮下和背最长肌脂肪前体细胞增殖与分化的影响

试验首先建立了30日龄猪皮下脂肪和背最长肌组织块培养及皮下和肌内脂肪前体细胞体外培养体系,共设2个处理,处理1为阴性对照（添加0.1mmol/LBSA）,处理2添加100μmol/L的t10,c12-CLA,每个处理设6个平行,接种时即加入BSA与t10,c12-CLA进行处理至第10天。试验全期通过MTT法（采用上述脂肪前体细胞培养体系）及油红O染色技术（采用上述组织块培养体系）从细胞形态学角度探讨t10,c12-CLA对皮下和肌内脂肪前体细胞增殖与分化的影响,同时采用荧光定量PCR技术测定t10,c12-CLA对猪皮下和肌内脂肪前体细胞关键分化转录因子（PPARγ,ADD1,SEEBP1）的影响。MTT法和油红O染色结果表明,100μmol/Lt10,c12-CLA显著抑制了猪皮下脂肪前体细胞增殖与分化,显著促进了猪肌内脂肪前体细胞的分化（P〈0.05）,但对其增殖影响不显著,该部分结果从细胞形态学角度说明t10,c12-CLA对猪皮下和肌内脂肪前体细胞增殖与分化存在差异调控作用;荧光定量PCR结果表明,100μmol/Lt10,c12-CLA显著抑制了猪皮下脂肪PPARγ的基因表达,促进了猪背最长肌PPARγ和ADD1的基因表达（P〈0.05）,该部分结果从脂肪前体细胞分化调控角度说明t10,c12-CLA对猪皮下和肌内脂肪前体细胞增殖与分化的差异调控机制。     

t10,c12-CLA对猪皮下和背最长肌脂肪前体细胞增殖与分化的影响

试验首先建立了30日龄猪皮下脂肪和背最长肌组织块培养及皮下和肌内脂肪前体细胞体外培养体系,共设2个处理,处理1为阴性对照(添加0.1 mmol/L BSA),处理2添加100μmol/L的t10,c12-CLA,每个处理设6个平行,接种时即加入BSA与t10,c12-CLA进行处理至第10天.试验全期通过MTT法(采用上述脂肪前体细胞培养体系)及油红O染色技术(采用上述组织块培养体系)从细胞形态学角度探讨t10,c12-CLA对皮下和肌内脂肪前体细胞增殖与分化的影响,同时采用荧光定量PCR技术测定t10,c12-CLA对猪皮下和肌内脂肪前体细胞关键分化转录因子(PPARγ,ADD1,SEEBP1)的影响.MTT法和油红O染色结果表明,100μmol/L t10,c12-CLA显著抑制了猪皮下脂肪前体细胞增殖与分化,显著促进了猪肌内脂肪前体细胞的分化(P＜0.05),但对其增殖影响不显著,该部分结果从细胞形态学角度说明t10,c12-CLA对猪皮下和肌内脂肪前体细胞增殖与分化存在差异调控作用；荧光定量PCR结果表明,100 μmol/Lt10,c12-CLA显著抑制了猪皮下脂肪PPARγ的基因表达,促进了猪背最长肌PPARγ和ADD1的基因表达(P＜0.05),该部分结果从脂肪前体细胞分化调控角度说明t10,c12-CLA对猪皮下和肌内脂肪前体细胞增殖与分化的差异调控机制.     

t10,c12-CLA对猪皮下和背最长肌脂肪前体细胞增殖与分化的影响

试验首先建立了30日龄猪皮下脂肪和背最长肌组织块培养及皮下和肌内前脂肪细胞体外培养体系,共设2个处理,处理1为阴性对照(添加0.1mmol/lBSA),处理2添加100μmol/l的t10,c12-CLA,每个处理设6个平行,接种时即加入BSA与t10,c12-CLA进行处理至第10d。试验全期通过MTT法(采用上述前脂肪细胞培养体系)及油红O染色技术(采用上述组织块培养体系)从细胞形态学角度探讨t10,c12-CLA对皮下和肌内脂肪前体细胞增殖与分化的影响,同时采用荧光定量PCR技术测定t10,c12-CLA对猪皮下和肌内脂肪前体细胞关键分化转录因子(PPARγ,ADD1,SEEBP1)的影响。MTT法和油红O染色结果表明:100μmol/lt10,c12-CLA显著抑制了猪皮下脂肪前体细胞增殖与分化,显著促进了猪肌内脂肪前体细胞的分化(P0.05),但对其增殖影响不显著,本部分结果从细胞形态学角度说明t10,c12-CLA对猪皮下和肌内脂肪前体细胞增殖与分化存在差异调控作用、荧光定量PCR结果表明:100μmol/lt10,c12-CLA显著抑制了猪皮下脂肪PPARγ的基因表达,促进了猪背最长肌PPARγ和ADD1的基因表达(P0.05),本部分结果从前脂肪细胞分化调控角度说明t10,c12-CLA对猪皮下和肌内脂肪前体细胞增殖与分化的差异调控机制。     

鸡胚原始生殖细胞诱导分化为神经元样细胞的研究

原始生殖细胞（Primordial Germ Cells：PGCs）是指能够发育为性细胞的前体细胞,可作为胚胎干细胞（ES）分离与克隆的一种新型材料,其形态、表面标志、体内外分化潜能及体外培养条件均类似于胚胎干细胞.体外培养过程中,在培养液中加入一定的诱导分化剂,PGCs细胞将发生定向分化.长期以来神经系统损伤和神经退行性病变是临床上难以解决的问题,由于原始生殖细胞具有发育全能性,可以在体外通过对其进行定向诱导,得到特定类型的细胞,这将使原始生殖细胞成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的来源.本试验采用不同的诱导剂对PGCs进行诱导,以探讨PGCs细胞向神经细胞分化的适宜条件.     

猪肌内脂肪前体细胞分离培养和成脂诱导分化研究

为建立猪肌内脂肪前体细胞分离培养方法,为后续进行猪肌内脂肪沉积相关基因功能研究提供细胞模型,本研究采用胰酶消化法结合细胞差速贴壁法分离猪肌内脂肪前体细胞,通过诱导分化成功诱导出脂肪细胞,并进行油红O染色和甘油三酯含量检测。结果表明:采用胰酶消化结合细胞差速贴壁法能够成功分离出猪肌内脂肪前体细胞并稳定传代,获得的细胞纯度高,增殖和分化能力旺盛,具有典型特征的肌内脂肪前体细胞,冻存活率达90%以上;油红染色及甘油三酯含量检测结果显示,诱导分化第3天细胞内开始形成脂滴,第9天脂质沉积达高峰,继续培养至12 d甘油三酯含量增加不明显。综上,采用胰酶消化法结合细胞差速贴壁法能够获得稳定的猪肌内脂肪前体细胞,可为后续的基因功能分析提供实验素材。     

荷斯坦牛骨髓间充质干细胞的分离培养和体外诱导分化的研究

本试验采用密度梯度离心法来分离纯化和体外培养荷斯坦牛骨髓间充质干细胞,并在体外分别诱导其分化为神经样细胞和脂肪样细胞.结果表明,采用密度梯度离心法可获得纯化度较高的荷斯坦牛骨髓间充质干细胞,并且在一定的诱导条件下能够分化为脂肪样和神经样细胞,为利用骨髓间充质干细胞作为核供体进行核移植的研究和动物遗传资源的保存研究奠定理论基础.     

动物组织细胞培养中的若干技术问题

动物组织细胞培养中的若干技术问题徐彬孙虹（华南农业大学动物医学系广州５１０６４２）（兰州段家滩奶牛场）细胞培养就是在一定条件下，使动物体细胞在体外组织未分化状态下进行大量增殖。由于被培养的细胞是非常好且方便的实验对象，因此在现代医学和生物科学研究中得...     

鸡脂肪细胞分化调控的研究进展

脂肪细胞增殖与分化的异常会引发肥胖、胰岛素抵抗及Ⅱ型糖尿病等多种疾病.目前,对哺乳动物脂肪细胞分化的研究已经取得了一定的进展,但是关于鸡脂肪细胞的相关报道还比较少见.鸡前脂肪细胞分化的分子调控机制与哺乳动物有所不同,如对体外分化诱导剂的要求及分化过程中转录因子的表达时序等.本文综述了鸡前脂肪细胞的原代培养和体外诱导分化...     

家蚕晚期胚胎原代细胞分化和转分化的研究

对家蚕晚期胚胎组织进行原代培养,记录了培养过程中出现的多种分化和转分化现象。发现已分化的晚期胚胎组织、细胞尚可继续分化和转分化形成各种不同类型的组织与细胞,而且这些细胞多有一定的增殖能力,暗示了家蚕晚期胚胎组织可能有多种内部器官组织的多能干细胞存在。     

摘除咽下神经节对家蚕蛹脂质代谢的影响

于化蛹前将老熟蚕儿咽下神经节摘除,在蛹体发育过程中,卵巢中甘油三酯、游离脂肪酸等脂质的相对含量减少,而脂肪体、血液中的脂质积累量增加。表明咽下神经节对蛹期脂质在脂肪体、血液及卵巢等组织器官间的转运和积蓄,具有一定的调节作用。     

家蚕丝氨酸蛋白酶BmHP14基因的克隆与表达模式分析

家蚕受到外源微生物侵染或损伤时,前酚氧化酶原级联反应中的起始丝氨酸蛋白酶会激活下游信号通路,最终产生黑色素。采用RACE技术,获得了家蚕前酚氧化酶原级联反应起始丝氨酸蛋白酶——血淋巴蛋白酶编码基因的全长cDNA序列,命名为BmHP14(GenBank登录号:JQ954757)。BmHP14 cDNA全长2 508 bp,开放阅读框为2 013 bp,编码670个氨基酸,预测蛋白质分子质量71 kD,等电点5.09,N端17个氨基酸预测为信号肽序列。多重序列比对显示BmHP14与烟草天蛾HP14的相似度很高,达到57%;分子进化树中二者也聚为一支。RT-PCR分析表明,BmHP14在家蚕5龄第3天幼虫脂肪体、马氏管、精巢、卵巢、表皮、血细胞、头部均有表达,其中以脂肪体中的表达水平最高。以黑胸败血芽孢杆菌、大肠杆菌、球孢白僵菌注射侵染家蚕5龄第3天幼虫,Real-time PCR检测显示在受到病菌侵染后,幼虫脂肪体中的BmHP14表达上调。Westernblotting检测结果显示,BmHP14在家蚕体液中以前体和成熟体的形式共同存在。研究结果提示,BmHP14是家蚕前酚氧化酶原级联反应信号通路中的关键酶。     

蜕皮激素诱导家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的表达变化

昆虫蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)是一种核内受体,为蜕皮激素的分子靶标。用0.002 g/L蜕皮激素溶液浸泡过的桑叶饲喂家蚕5龄幼虫,采用双跟踪标定定量PCR(dual-spike-in qPCR)方法,检测家蚕蜕皮激素受体基因BmEcR-A、BmEcR-B1和超气门蛋白(ultraspiracle,USP)基因BmUSP在家蚕幼虫马氏管、脂肪体、中肠组织的转录水平变化,分析蚕体组织以及BmEcR和BmUSP基因在蜕皮激素代谢过程中的作用与表达调控特征。结果表明:家蚕EcR的2种同工型基因BmEcR-A和BmEcR-B1的mRNA转录水平均变化显著,在脂肪体中的转录水平最高,其它组织相对较低;BmUSP的mRNA转录水平同样变化显著,且在脂肪体中的转录水平最高,马氏管次之,中肠最低。另检测正常情况下4龄眠期和5龄末期BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP的mRNA转录水平相对于其它发育时期较高,且脂肪体中的转录水平要明显高于其它组织。BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP均在家蚕幼虫脂肪体中高水平表达,表明了脂肪体在蜕皮激素代谢过程中的重要性。     

崂山奶山羊永生化骨髓间充质干细胞的诱导分化研究

为研究崂山奶山羊永生化骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化潜能,采用P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs进行体外成脂和成神经诱导分化。结果显示,当细胞传至P30代时,TERT-BMSCs生长旺盛;在成脂诱导后,P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs均能观察到细胞中透明脂滴的形成,油红O染料染色后可见脂滴被染成红色;在成神经诱导后,P3代BMSCs和P30代TERT-BMSCs均能形成树突样或三角形的形态,甲苯胺蓝染色后可观察到细胞中尼氏体的存在。综上提示,永生化的崂山奶山羊BMSCs在多次传代后仍具有较强的多向诱导分化能力,这为永生化MSCs的广泛应用提供了理论依据。     

从家蚕体分离的一种新微孢子虫SLN1的研究

从家蚕体中分离到一种新的病原性微孢子虫SLN1,其孢子形态大小与Nosemabombycis相似 ,而极丝较短。感染寄生于肌肉、气管上皮细胞、脂肪等组织 ,致病性弱 ,胚种传染率低。在孢子形成期产生多孢子芽膜 ,孢子形成数为 8个 ,与Nosemabombycis无血清学关系 ,分类于Thelohania属。     

家蚕乙醇脱氢酶基因的表达特征及乙醇在蚕体内的代谢分析

乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)是生物体内重要的乙醇代谢酶。生物信息学分析显示家蚕基因组中存在7个ADH编码基因(BmADH1～BmADH7),半定量RT-PCR检测BmADH2、BmADH3、BmADH4和BmADH5在家蚕5龄第3天幼虫的丝腺中表达水平较高,BmADH1、BmADH6、BmADH7在脂肪体中高水平表达。利用直接注射和口器灌喂2种方式,对家蚕5龄第3天幼虫分别以体积分数28%、56%的乙醇进行刺激处理后,调查家蚕体内乙醇的代谢与脂肪体中ADH基因的表达及酶活性变化。半定量RT-PCR检测表明56%乙醇注射处理组家蚕的脂肪体中BmADH1、BmADH6、BmADH7的表达上调,而28%乙醇处理后3个基因的表达基本无变化;酶活性检测表明28%、56%乙醇处理后1 h家蚕脂肪体中的ADH活性均显著升高(P<0.05);气相色谱分析显示家蚕血液中的乙醇会快速转化为乙醛。以上结果表明,家蚕幼虫在受到高浓度乙醇刺激后,通过上调脂肪体内的ADH基因的表达,增强ADH活性,使其参与体内乙醇的代谢过程,以保护蚕体免受高浓度乙醇的伤害。     

家蚕防御素基因的序列特征与表达模式分析及原核表达试验

家蚕防御素(defensin)是家蚕抗菌肽家族的主要成员之一,为家蚕先天性免疫的重要效应因子。采用生物信息学方法分析家蚕防御素基因BmdefA、BmdefB的序列中各有2个外显子,2个基因分别定位于家蚕第4号和第13号染色体上;等电点预测BmdefA带有负电荷,属于罕见的阴离子型抗菌肽,而BmdefB带有正电荷,属于常见的阳离子型抗菌肽;预测2个基因编码的成熟肽分子质量均在4 kD左右。用RT-PCR方法检测BmdefA在家蚕整个发育过程中有表达,且在检测的幼虫和成虫各组织中均有表达;BmdefB从幼虫5龄第3天到成虫期表达,雄性表达量高于雌性,且在5龄第3天幼虫的生殖腺、脂肪体和血细胞中高水平表达。家蚕防御素BmdefA、BmdefB具有不同的分子特性和表达特征,暗示它们在家蚕先天免疫过程中可能行使不同的功能,甚至可能具有不同的抗菌机理。构建融合GST标签的家蚕防御素基因原核表达载体,通过在大肠杆菌细胞内诱导表达,获得可溶性的目的蛋白,使用GST亲和层析柱初步纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting鉴定,为进一步研究BmdefA、BmdefB的体外活性和抑菌机制奠定基础。     

保幼激素类似物对家蚕后部丝腺细胞核糖核酸组分含量动态的影响

家蚕后丝腺和脂肪体总RNA含量随着五龄期的增长而增加,在五龄中期达到最高水平.用Sepharose2B柱层析分离RNA各组分,观察到家蚕后丝腺rRNA,tRNA和mRNA的含量在五龄期的变化均与总RNA相对应.JHA ZR515处理家蚕后,后丝腺的RNA及其组分rRNA.tRNA和mRNA均明显增加.脂肪体RNA也有增加.这些结果显示出JHA增丝的原因可能与JHA在转录和翻译水平上促进了丝素蛋白基因的表达有关.     

利用非转座子载体介导的转基因家蚕表达人胰岛素样生长因子Ⅰ

为了实现利用非转座子载体介导的转基因家蚕整体表达人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ),将hIGF-Ⅰ基因克隆进非转座子类型的昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,构建转基因载体pIZT/V5-His-hIGF-Ⅰ。利用精子介导法将该转基因载体导入家蚕卵,通过绿色荧光筛选并结合PCR和Dot blotting检测鉴定,表明已成功获得hIGF-Ⅰ转基因家蚕。对培育至G2代的转基因家蚕5龄幼虫蛋白质样品进行Western blotting分析,结果显示hIGF-Ⅰ在转基因家蚕中获得表达,重组hIGF-Ⅰ的分子质量约12.5 kD;ELISA检测hIGF-Ⅰ在G2代转基因家蚕5龄幼虫全蚕以及后部丝腺、脂肪体冻干粉中的质量比分别为65、411、469 ng/g。试验结果再次证实通过非转座子载体pIZT/V5-His介导可以将外源基因导入家蚕基因组,并实现外源基因在转基因家蚕中整体表达。     

家蚕谷胱甘肽硫-转移酶的组织分布及发育期变化规律

为明确家蚕谷胱甘肽硫-转移酶(GSTs)的生物学信息,对家蚕不同发育阶段GSTs的变化规律、5龄幼虫主要组织及不同品种间的GSTs活性差异进行了研究。家蚕GSTs在中肠、脂肪体、血淋巴、表皮、头部等组织中都有分布,脂肪体中GSTs活性最高,其次是中肠,头部最低。各发育阶段中,在由一种虫态变为另一种虫态的初始期GSTs活性较高,以后逐渐降低。在幼虫主要组织中GSTs活性5龄第3天最高,以后逐渐下降,至吐丝前达到较低的水平。抗性较强的夏秋蚕品种的GSTs活性高于春用蚕品种,杂交种的GSTs活性高于原种。研究结果提示家蚕GSTs活性与其组织器官的生理功能、品种抵抗性等相关联。