荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素基因克隆及其原核表达质粒的构建

根据已发表的牛β-防御素基因序列设计引物,从具有临床乳腺炎症状的荷斯坦奶牛血液中性粒细胞中提取RNA,克隆牛β-防御素基因并插入到原核表达载体pQE-30中,构建了原核表达质粒pQE-30/β-defesion。测序结果表明,克隆的目的基因长189bp,编码1个氨基酸,与已报道的牛β-防御素氨基酸序列同源性达95.6%。本研究为牛乳腺防御素的表达及功能、活性的研究奠定了一定的基础。     

猪防御素PBD-1基因的克隆及其表达载体构建

将猪防御素基因PBD-1分成5段人工合成,然后再通过PCR方法将这5小段延伸成完整的PBD-1基因序列,并使其两端在合成后分别带上酶切位点和保护碱基.将该基因定向插入带有相同酶切位点的真核表达质粒pcDNA3.1( )的多克隆位点上构建表达质粒.重组质粒经双酶切电泳分析、序列鉴定,表明PBD-1基因表达载体构建成功,为进一步研究PBD-1基因表达产物的抗菌活性及其抗菌机理打下基础.     

绵羊防御素(sBD-1)cDNA的克隆及其植物中表达载体的构建

为了获得在植物中表达的绵羊防御素 ,从绵羊舌表皮组织中分离提取总RNA ,经逆转录PCR (RT PCR)扩增出绵羊防御素sBD 1全长cDNA ,回收扩增产物连接到克隆载体 ,测序分析表明该cDNA为 2 1 5bp ,与报道序列完全一致。将该序列替换插入质粒PBI1 2 1中的GUS编码序列 ,构建植物表达载体PBIC 35SsBD1 ,为进一步进行转基因植物和绵羊防御素功能的研究奠定了基础。     

兔防御素NP2基因克隆及其毕赤酵母表达的研究

根据兔防御素NP2基因序列和Pichia酵母密码偏爱性，设计兔防御素NP2基因序列片段，构建pGAPZαA酵母表达重组子，转化E．coli JM109，扩增重组子，经限制性内切酶BlnI线性化，转Pichia酵母。PCR扩增挑选阳性转化子，SDS-PAGE电泳分析兔防御素NP2酵母表达、Bradford法蛋白质定量和抗菌试验。结果表明：兔防御素NP2可在Pichia酵母中表达，且对大肠杆菌具有显著的抗菌作用，为兔防御素NP2深入研究和开发利用奠定了一定的物质和理论基础。     

鸡防御素基因GAL-2的克隆及其真核表达载体的构建

采用RT-PCR方法从15日龄的仔鸡肾组织的总RNA中扩增出鸡防御素基因(GAL-2)序列,然后将其亚克隆到载体pIRES2-EGFP构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-GAL-2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到Marc145细胞中进行瞬时表达,荧光检测证实细胞转染成功。pIRES2-EGFP-GAL-2真核表达载体的成功构建为下一步在细胞水平研究GAL蛋白功能以及进一步将其开发为兽用生物制品奠定了基础。     

兔防御素基因NP-1的克隆及其在大肠杆菌中的表达

选用大肠杆菌偏嗜性的密码子对兔防御素基因NP-1进行改造,人工合成编码NP-1成熟肽的基因片段,并将其克隆到T-easy载体上,再经双酶切后重组于原核表达载体pMAL-p2X。经IPTG诱导后,在大肠杆菌TB1中融合表达出兔防御素NP-1成熟肽。     

串联抑制素重组质粒的构建

根据GenBank中报道的猪抑制素基因序列设计两对引物，克隆含有抑制素抗原决定簇基因片段α（1～32）的p1INH和p2INH，在这两个片段中都设有限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点，通过XbaⅠ把plINH与p2INH串联起来。串联抑制素基因片段与pcDNA3．1载体通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点连接后经过转化DH5a感受态细菌构建重组载体。以重组载体作为模板，以含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点的引物进行PCR，产物经验证为含串联的抑制素基因。串联的抑制素基因产生的融合蛋白具有抑制素的免疫原性，且不会与体内其他蛋白发生免疫交叉反应。串联后的基因片段在单位体积内的抗原位点数增多，免疫效果也会加强。可以反馈性地抑制FSH的分泌，提高母畜的排卵数，提高产仔数。     

串联抑制素重组质粒的构建

根据GenBank中报道的猪抑制素基因序列设计两对引物,克隆含有抑制素抗原决定簇基因片段α(1～32)的plINH和p2INH,在这两个片段中都设有限制性内切酶Xba Ⅰ的酶切位点,通过Xba Ⅰ把p1INH与p2INH串联起来.串联抑制素基因片段与pcDNA3.1载体通过EcoR Ⅰ、HindⅢ酶切位点连接后经过转化DH5α感受态细菌构建重组栽体.以重组载体作为模板,以含有EcoR Ⅰ、HindⅢ酶切位点的引物进行PCR,产物经验证为含串联的抑制素基因.串联的抑制素基因产生的融合蛋白具有抑制素的免疫原性,且不会与体内其他蛋白发生免疫交叉反应.串联后的基因片段在单位体积内的抗原位点数增多,免疫效果也会加强.可以反馈性地抑制FSH的分泌,提高母畜的排卵数,提高产仔数.     

鸭β-防御素-2基因的克隆测序与组织表达分析

利用RT-PCR技术,从肝脏组织中扩增到鸭AvBD2基因.经测序表明,扩增到的鸭AvBD2大小为350 bp,含有1个大小为195 bp的开放阅读框,编码64个氨基酸残基.组织表达分析表明,鸭AvBD2基因在鸭脾脏和肾脏中大量表达;心脏和肝脏中有少量表达;肺脏和骨髓有中等水平表达;在胸腺、腔上囊、小肠、胰腺、腺胃、食管、气管、舌头、胸肌、卵巢、皮肤中未见表达.     

牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达.提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体.     

真核表达NDV F基因重组质粒的构建及其在CEF细胞中的转染

通过PCR方法自含NDVZF基因的克隆质粒中扩增NDVF基因 ,将其与真核表达载体pcDNA3..1/V5_His_TOPO重组。经核酸内切酶酶切 ,阳性克隆鉴定准确无误 ,核酸序列测定结果与原始基因比较 ,同源性大于 99% ,启始密码和终止密码未出现变异 ,将该重组质粒命名为pcDNANDVZF。将pcDNANDVZF在脂质体作用下转染CEF细胞 ,用间接免疫荧光试验检测 ,结果证明pcDNANDVZF可在CEF细胞中大量表达F蛋白。     

pCDNA3-PTH真核表达载体构建及其在细胞内表达

以鸡甲状旁腺组织中总RNA为模板,采用RT-PCR法获得甲状旁腺素(PTH)cDNA。将该基因克隆至pCDNA3载体中,构建真核细胞表达载体pCDNA3-PTH,DNA测序证明获得了PTH基因,其序列与GenBank报道序列比较,核苷酸同源性为99.4%,在第159位处存在C→A的有意义突变。将测序正确的PTH基因在多聚乙肽亚胺(PEI)介导下转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了PTH在COS-1中的表达。PTH基因克隆和表达均获得成功,为进一步探讨该基因在改善蛋壳质量中的应用奠定了基础。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-V13KL的构建及在COS-7细胞和小鼠胚胎中的表达

构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-V13KL,瞬时转染COS-7细胞及对小鼠受精卵进行原核注射,旨在通过抗菌肽V13KL在COS-7细胞、小鼠胚胎中的表达情况评价其对细胞生理状态、胚胎发育方面可能产生的影响。结果显示,V13KL可以与EGFP在COS-7细胞中高效共表达,转染效率为75.8%,且原核注射后约10%的胚胎发育成带有绿色荧光的囊胚。     

新孢子虫SAG1-SRS2融合基因真核表达质粒的构建及表达

根据犬新孢子虫NcSAG1-NcSRS2融合基因序列,设计了1对含有Kozak序列、终止密码子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以含有NcSAG1-NcSRS2融合基因的质粒pGEX-tNcP43-P36为模板,经PCR扩增获得NcSAG1-NcSRS2融合基因片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSAG1-NcSRS2融合基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSAG1-SRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到COS-7细胞中进行瞬时表达,经免疫荧光检测,证实了该载体能在细胞内进行蛋白表达。     

鹅细小病毒延边株VP1基因真核表达质粒构建及其在Vero细胞中的表达

根据GenBank已发表的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列,设计并合成1对含有Xho I和BamH I酶切位点的特异性引物,以提取的GPV基因组DNA为模板,经PCR扩增得到了1 163 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建重组表达质粒pVAX1-VP1。经PCR鉴定、酶切分析和序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。通过脂质体法将pVAX1-VP1转染Vero细胞,经间接荧光抗体检测,在Vero细胞表面可见特异性荧光。经RT-PCR扩增得1 163 bp的目的片段。该研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础。     

旋毛虫T668基因真核表达载体的构建及其在BHK细胞中的表达

利用RT-PCR技术从中国河南猪旋毛虫(国际标准虫种编号为ISS534)新生幼虫得到T668基因,并克隆入pEGFP-N1真核表达载体中构建重组质粒,该重组质粒在脂质体介导下转染BHK细胞。EGFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,Western blotting鉴定,细胞裂解液样品中有1条约77 000的条带,可被绿色荧光抗体及猪感染旋毛虫阳性血清所识别,与预计大小一致,表明成功构建T668-pEGFP-N1真核表达质粒,并在BHK细胞融合表达,表达产物具有抗原性。     

鹅源副黏病毒HN基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究

本试验通过FCR技术从pGEM-HN质粒中扩增出了HR基因，构建了真核表达质粒pcDNA3-HN。真核表达质粒pcDNA3-HN肌肉注射免疫鸡后，HI血清抗体效价较空白对照组高，攻毒后鸡发病、死亡均少于空白对照组，有27%-36％的鸡耐过。但血清抗体效价较灭活苗组低，发病率和死亡率较灭活苗组高。试验结果表明HN基因在鸡体内，得到了表达，并使鸡获得了一定的免疫力，但保护作用不及鹅副黏病毒油乳剂灭活苗。     

猪IL-15 cDNA真核表达载体的构建、表达及其免疫佐剂效应

参考GenBank发表猪IL-15mRNA序列设计引物,用RT-PCR方法扩增猪IL-15cDNA,并克隆到pMD18-T载体中,通过PCR、酶切和测序验证克隆正确,再亚克隆到真核表达载体pcDNA-3.1（＋）上,得到重组质粒pcD-NA-pIL-15。在脂质体介导下,重组质粒pcDNA-pIL-15转染AD-293细胞。以鼠抗猪IL-15为一抗,用间接免疫荧光分析表明猪IL-15基因均在AD-293细胞中成功进行了瞬时表达。小鼠免疫试验表明,pcDNA-pIL-15作为免疫佐剂,能够有效提高小鼠的脾T细胞增殖,加强pcDNA-ORF2（PCV2）质粒免疫过程中的特异性中和抗体的产生,为进一步研制猪IL-15基因佐剂疫苗及进行临床实验奠定基础。     

猪IL-2基因真核表达载体的构建及在酵母中的表达

用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因，将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E．coli的JM109中，得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17ku大小的分泌性目的蛋白，采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化，纯化结果理想。