半巢式RT-Realtime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系

马铃薯Y病毒脉坏死株系(Potato virus Y,PVYn)是马铃薯中一个非常重要的病毒病害.本文根据PVYn基因组中RNA依赖的RNA聚合酶基因序列保守区域,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式RT-Realtime PCR检测PVYn的新方法.该方法采用E.Z.N.ATM陕速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术.第二步半巢式RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Real time PCR等方法高.实验结果表明,该方法检测灵敏度可达4fg/μL植物总RNA.     

贵州马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆与遗传分析

本研究从中国贵州不同海拔地区采集感染马铃薯Y病毒(PVY)病害叶片,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)方法克隆到长度为804 bp的8个目的片段,序列分析表明为PVY外壳蛋白(PVY-CP)基因.通过与已经发表的PVY-CP基因序列进行比较和遗传分析,并根据PVY的CP基因全长和5'端序列构建系统发育树,结果表明,本研究分离的PVY,7株为O株系,1株为NTN株系.     

马铃薯S病毒RT-qPCR通用检测体系的建立与应用

为实现准确和快速鉴定PVS及其株系,明确PVS在马铃薯叶片、叶柄、茎、根和休眠块茎中含量以筛选适合的检测部位,设计PVS通用简并引物,建立实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术体系,分析熔解曲线鉴定PVS^O和PVS^A株系。以马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯M病毒(PVM)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯卷叶病毒(PLRV)阳性样品为对照检测其特异性。应用PVS^O和PVS^A重组质粒分别建立标准曲线,检测接种PVS^O和PVS^A马铃薯品种尤金和冀张薯12号的5个部位PVS含量。另外,应用该体系检测来源于11个省(市、自治区)的90个PVS阳性样品验证其实用性。PVS^O和PVS^A扩增后熔解曲线分别在85.77～86.00℃和87.78～87.91℃出现特异峰,PVS阴性样品及PVX、PVY、PVM、PVA和PLRV阳性样品的熔解曲线均无上述特异峰。PVS^O和PVS^A...     

马铃薯卷叶病毒与S病毒重组双CP多克隆抗体的制备

为了制备出马铃薯卷叶病毒(PLRV)与S病毒(PVS)重组双CP多克隆抗体并用于PLRV与PVS这2种病毒的间接与DAS-ELISA检测,构建了PLRV与PVS融合双CP基因的原核表达载体pET22b-LRCP/SCP,用超声破碎法代替溶菌酶法裂解重组菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)并提取菌体蛋白,用镍离子亲和层析纯化获得了分子质量为51.2 ku的高纯度的重组双CP。用该重组双CP作抗原免疫家兔获得了高效价(1∶128 k)抗血清。纯化的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性标准物特异性结合,与另外4种马铃薯主要病毒(PVX、PVY、PVA与PVM)无交叉反应。间接ELISA反应中,稀释度为1∶3 200的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性物都呈现阳性反应;在DAS-ELISA反应中,稀释度均为1∶100的重组双CP多克隆抗体及其碱性磷酸酶标记物与PLRV或PVS的阳性标准物也分别呈现阳性反应。结果表明,制备的重组双CP抗体既可用于PLRV与PVS这2种病毒的间接ELISA检测,也可用于DAS-ELISA检测。     

半巢式RT-Reahime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系

马铃薯Y病毒脉坏死株系（Potato virus Y，PVY^n）是马铃薯中一个非常重要的病毒病害。本文根据PVY^n基因组中RNA依赖的RNA聚合酶基因序列保守区域，设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针，建立了半巢式RT—RealtimePCR检测PVY^n的新方法。该方法采用E．Z．N．A^TM．陕速提取植物总RNA，并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术。第二步半巢式RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大，也是对第一步PCR产物的确认，因此，检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Realtime PCR等方法高。实验结果表明，该方法检测灵敏度可达4fg／μL植物总RNA。     

马铃薯卷叶病毒(PLRV)内蒙古分离物基因间隔区(IS)的克隆与序列分析

根据Genbank已报道马铃薯卷叶病毒(PLRV)基因组序列,分析其基因间隔区(IS)两端的保守区,自行设计、合成一对特异性引物,以PLRV内蒙古分离物总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到含PLRVIS的一段369 bp的cDNA,克隆于载体pBS-T中。重组质粒经PCR鉴定、酶切分析和核苷酸序列测定,并进一步与PLRV其他分离物的同源序列作比对。结果表明:克隆的PLRV内蒙古分离物的IS序列与其他全部已发表的13个全基因组中的IS核苷酸序列有很高的同源性,最高达到100%,平均为97.90%,高于这13个PLRV全基因组序列96.81%的同源性,说明IS序列不仅在PLRV的不同株系间比较保守,而且在PLRV的全基因组序列中也是相对保守的。研究结果预示,将IS构建成RNA干扰型结构导入马铃薯,将有可能获得抗PLRV多种株系且抗性更高的转基因植株。     

马铃薯X病毒25 kD运动蛋白基因和外壳蛋白基因介导的抗病性研究

以马铃薯X病毒（potato virus X,PVX）的RNA为模板,应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法分别扩增出长度为681 bp的非翻译马铃薯X病毒25 kD运动蛋白基因（PVX-p25）和长度为714 bp的非翻译马铃薯X病毒外壳蛋白基因（PVX-CP）。并分别构建植物表达载体pROKⅡ-p25和pROKⅡ-CP。利用农杆菌介导方法转化烟草NC89。经卡那霉     

葡萄卷叶病毒株系分化的研究

葡萄卷叶病毒株系分化的研究ＡＳｔｕｄｙｏｎＤｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＶｉｒｕｓＩｓｏｌａｔｅｓＡｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＧＬＲＶ葡萄卷叶病毒（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅｌｅａｆｒｏｌｖｉｒｕｓ．ＧＬＲＶ）是甜菜黄化病毒组成员，病毒粒子丝状物约１８００～...     

柑橘衰退病毒中国分离物HB1的血清学特性研究

利用3种不同来源的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)抗体(PAb-L5、PAb-I、MAbs-S4)对武汉地区发生的CTV进行检测,筛选到一个表现特异血清学性状的分离物CTV-HB1,该分离物仅同来源于中国的多克隆抗体PAb-L5发生血清学反应.为揭示该血清学差异的分子机制,对CTV-HB1和其他几个分离物CP基因序列进行了分析,结果显示:CTV-HB1 CP基因与其他19个分离物的核苷酸序列相似性在90.4%-99.4%,但CTV-HB1和CTV-L5的CP基因氨基酸序列间仅存在3个位点的变异,暗示:此3个氨基酸位点可能与CTV-HB1的血清学特性有关.     

葡萄A病毒外壳蛋白基因克隆及分子变异分析

为获得葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)外壳蛋白(CP)基因,并为开展GVA-CP介导的抗病毒转基因研究提供基础,本研究从葡萄休眠枝条中扩增获得12个GVA分离物的CP基因序列,全长597nt,编码198个氨基酸。所得分离物间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.9%~99.8%和92.4%~99.5%,与GenBank中12个GVA CP序列比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为71.0%~93.1%和81.8%~98.0%。系统进化分析表明,本研究12个分离物CP序列与已报道的GVA Ⅰ组亲缘关系最近。种群变异分析表明,GVA种群具有多种变异体类型,并且多个样品存在不同变异体类型的复合侵染。但绝大多数变异体克隆聚集在GVA Ⅰ组分支,有60%的克隆序列间同源性较高,并且聚集在同一个次级分支Ⅰ Aa,表明其为该GVA种群的优势序列。克隆的GVA CP基因以及优势序列群体的分析为葡萄抗病毒转基因研究奠定了基础。     

乌头花叶病病原物的分子鉴定

研究旨在通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从分子方面鉴定附子地道产区四川江油乌头花叶病植株的病原物种类及分析其特性。通过对黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的外壳蛋白基因(Coat Protein,CP)设计特异引物,对江油中坝附子GAP生产基地的乌头花叶病植株进行克隆、转化并测序。结果表明：从江油花叶病乌头植株中克隆得到基因大小为375 bp的片段,鉴定为黄瓜花叶病毒,命名为CMV-FZ,该序列为一段有效的长为375 nt的氨基酸编码区,推测编码125个氨基酸残基。依据外壳蛋白核苷酸序列建立了CMV不同分离物的系统进化树并对该序列进行蛋白组学分析,CMV-FZ与国内外已报道代表性CMV亚组分离物CP基因的核苷酸与氨基酸的序列相似性为74.8%~98.2%和73.4%~99.2%,其中与与CMV亚组II的核苷酸和氨基酸序列相似性为96.1%-98.2%和96.0%-99.2%,该分离物与中国分离物（CMV-PCT2）氨基酸序列相似性最高,达到99.2%。遗传进化分析显示,CMV-FZ与中国分离物（Zin和Hubei-1）和美国分离物（DKRD）亲缘关系较近,聚在同一分支,属于CMV亚组II。以上结果表明伴有花叶症状的乌头受到黄瓜花叶病毒的侵染。     

惠州马铃薯卷叶病毒病原分子鉴定及序列分析

对广东省惠州市疑似感染马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的病株毒源进行分子生物学鉴定,为广东省马铃薯卷叶病的防治提供参考。依据CP基因设计的一对特异引物,以马铃薯总RNA为模板,应用RT-PCR技术,成功扩增出336bp的DNA片段。用BLAST对序列进行同源性分析,用Clustal X构建PLRV的聚类图。结果表明:4个惠州PLRV不同分离物的DNA序列和氨基酸结构具有高度同源性,惠州PLRV分离物与国内外13个PLRV分离物具有高度同源性。广东省惠州市的疑似病株确定为感染PLRV的马铃薯病株。     

黄瓜花叶病毒番茄蕨叶分离物外壳蛋白基因的克隆和序列分析

在北京延庆的番茄上分离到1株黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)分离物CMV-YQ,该分离物在番茄上造成严重的蕨叶、矮化,在烟草上表现花叶、矮化和畸形,表现出很强的致病性。根据黄瓜花叶病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR技术对其CP基因片段进行了扩增并克隆,获得了含该基因全长657 bp的cDNA片段。序列测定与比较分析结果表明,北京地区造成番茄蕨叶的CMV分离物CP基因片段核酸序列与GenBank上CMV亚组Ⅰ其他分离物同源性高达90%～99%,属于CMV亚组Ⅰ。该分离物与分离于我国芭蕉的另一亚组Ⅰ分离物GB同源性为94.37%,两分离物之间存在寄主适应性变异。     

马铃薯Y病毒株系分类及中国大田马铃薯感染的马铃薯Y病毒株系谱研究进展

为了更科学、合理地检测、检疫马铃薯Y病毒(PVY)株系,和全面掌握侵染中国大田马铃薯的PVY株系情况,总结了PVY株系的分类方法,分析了中国大田马铃薯感染的PVY株系谱。认为目前广泛使用的血清型划分法、基因组重组与否划分法、PTNRD效应划分法、过敏反应互作基因划分法,以及Singh等提出的株系群划分法都无法对PVY株系予以完全合理的划分。提出有必要鉴定PVY基因组中决定马铃薯病理效应的基序并通过对基序测序来鉴定PVY株系,通过对株系间基因组差异区段的短序列测序来鉴定PVY株系是目前最接近基序测序分类法的思路。指出感染中国大田马铃薯的PVY目前有PVY^O、PVY^N、PVY^NTN、PVY^N:O、PVY^N-Wi和PVY^NW这6种株系,隶属于2个株系群PVY^O和PVY^N,其中PVY^N株系和PVY^N株系群病样占绝大多数,以非重组株系为主,但重组株系已占一定比例,其发展趋势值得关注。     

马铃薯A病毒重组CP多克隆抗体的制备及其在DAS-ELISA检测中的应用

利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA测定2种抗体的活性,目测及OD值测定结果表明3种ELISA测定反应都呈阳性。以PVA病毒阳性标准物为抗原,在上述3种ELISA测定中也呈阳性反应,重组CP多克隆抗体及其酶标抗体与PVA有较强的反应信号。利用重组CP制备的多克隆抗体及其酶标抗体达到了马铃薯A病毒DAS-ELISA检测的要求。     

烟草PVY抗性的遗传分析与分子标记筛选

本文以抗马铃薯Y病毒(简称PVY)的烟草品种RY5,感病品种Coker176为亲本,构建F1、正反交F2和正反交BC1群体,苗期摩擦接种PVY的抗性遗传分析结果表明,接种后第21d群体PVY抗性数据符合孟德尔单基因隐性质量性状的遗传模型。接种后第28d群体PVY抗性数据偏离孟德尔单基因隐性质量性状的遗传模型。提取F2代群体中抗病和感病单株DNA,从多条RAPD引物和一对SCAR引物中,筛选出两个紧密连锁的分子标记。RAPD标记O12V3695与RY5的抗病基因对应的显性等位基因位点(Va)间的遗传距离为2.10cM,而SCAR标记与Va间的遗传距离为2.52cM,这两个分子标记可用于抗PVY抗性育种。