用ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体

用ELISA对青海部分存栏猪进行了猪伪狂犬病血清抗体检测。共检测了5县（市）的920份猪血清，其中阳性150份，阳性率为16．30％。说明我省猪群中有猪伪狂犬病的存在。     

间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体

用猪肾传代细胞IBRS－2增殖猪伪狂犬病病毒（PRV）鄂A株，病毒培养上清液经硫酸铵沉淀、聚乙二醇（Mr20000）浓缩后作为包被抗原。用纯化的猪血清IgG免疫家兔，HRP村记撮的兔抗猪IgG，制备出高效价的酶标抗体，酶标抗体工作浓度为1：50000；经各种条件的选择，建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的间接ELISA。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为39.2mg/L，血清最佳稀释度为1：20，与猪细小病毒、猪、O型口蹄疫、猪衣原体标准阳性血清呈阴性反应，与标准阴性血清和临床未感染PRV的猪血清呈阴性反应；与猪伪狂犬病标准阳性血清、免疫猪血清和临床发病猪血清呈明显的阳性反应；与美国进口的PRV抗体检测ELISA诊断试剂盒检测结果比较，45份猪血清的阴、阳性检出符合率均为100％。表明建立的间接ELISA具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点，可用于猪伪狂犬病血清抗体的定性和定量检测。     

猪伪狂犬病PCR与ELISA检测方法研究进展

猪伪狂犬病(PR)在全球广泛流行,给猪养殖业造成了严重的损失。如何实现对该病快速、准确、方便、价廉地的诊断具有重要意义。PCR和ELISA具有操作简便、灵敏度高、结果判定简单、成本低等优点,可广泛应用于一线兽医队伍快速检测PR。本文就PCR和ELISA技术在猪伪狂犬病诊断方面的最新研究情况进行了综述,以期为PR的快检快筛检测提供参考。     

ELISA在猪伪狂犬病诊断中的应用

近年来 ,猪伪狂犬病不断传播蔓延 ,给世界养猪业带来了巨大危害 ,因此开发特异性强、敏感性高、简便、快速、能区别疫苗毒和野毒、能检出潜伏感染的诊断方法是防制该病的关键之一。EL ISA方法具有特异、敏感、快速、稳定等特点 ,为广大兽医工作者所关注。目前 ,国内外关于 EL ISA在猪伪狂犬病诊断中的应用方面的研究已有不少 ,已有试剂盒出售。笔者综述了应用于猪伪狂犬病诊断的多种 EL ISA方法 ,如直接 EL ISA、间接 EL ISA、竞争 EL ISA、斑点EL ISA、SPA-EL ISA、双抗体夹心 EL ISA、单抗夹心 L AB-EL ISA、血清学鉴别 EL ISA等。这些方法中 ,有测病毒的 ,有测抗体的 ;有单抗介导的 ,有多抗介导的 ;有的还引入了 SPA和 L AB;有的以分子生物学为基础并能够鉴别疫苗毒和野毒。此外 ,还总结了目前所用 EL ISA诊断方法的优点和缺点 ,并预测了其发展前景     

猪伪狂犬病病毒间接ELISA检测方法的建立

以纯化的PRV抗原为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了可检测PRV血清抗体的间接ELISA诊断方法。标定抗原的最佳包被量为0.802μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为60min,判定标准为OD 450nm值大于0.357为阳性,小于0.296为阴性,在0.296与0.357之间为可疑。该方法检测其他6种常见猪病病毒(CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、JEV、TGEV)的阳性血清均为阴性;与商品化ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为90.0%、87.1%、92.3%。本研究建立的PRV间接ELISA抗体检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV免疫猪群抗体监测、快速诊断和PR流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

检测猪伪狂犬病抗体的3种ELISA试剂盒的比较分析

为评价用于检测猪伪狂犬病抗体的3种商用的试剂盒,择优选取一种作为本中心的检测试剂。用3种试剂盒检测386份免疫背景清楚的临床及试验血清,比较各试剂盒的检测阳性率、敏感性。结果386份血清经HIPRA、LSI和IDEXX试剂盒检测,检测阳性率分别为30.83%、59.84%和71.24%,且3种试剂盒相同血清的检测阳性率相互间差异均极显著性(P<0.01),但是对于高抗体水平的38份母猪血清检测阳性率相互间差异均不显著(P>0.05)。检测数据表明IDEXX与LSI两者相关系数为-0.941,检测定性完全相符率达81.12%。结果3种试剂盒检测阳性率、敏感性均以IDEXX为最高,LSI次之,HIPRA最低;IDEXX与LSI两者呈现强相关,造成阳性检测率差异显著的主要因素是方法的敏感性、试验结果的判定标准。     

3种ELISA试剂盒检测猪伪狂犬病gE抗体的比较

通过对猪伪狂犬病毒gE抗体的3种ELISA试剂盒比较试验数据分析,3种试剂盒检测值均呈极显著的相关关系(P<0.01)。检测定性结果一致程度较高,其中HIPRA与IDEXX一致性强度为极强(Kappa=0.808),且其符合率达89.4%;HIPRA与LSI、LSI与IDEXX均为高度一致(Kappa=0.732、0.724),且其符合率依次为85.6%、85.3%。经gE抗体阳性率检测结果统计学检验,3种试剂盒gE抗体阳性率之间差异均不显著(P>0.05),其检测灵敏度从高到低次序为LSI、IDEXX和HIPRA。临床应用数据分析表明,LSI检测样品存在1.26%假阳性结果,使用LSI检测gE抗体易造成临床猪伪狂犬误诊,为降低误诊率须加大检测群体的样本数或要求有阻断率≥76.73%的样品存在。在临床样品检测群体定性中HIPRA、IDEXX与临床相符率均达100%,LSI与临床相符率为95.5%,其中相符率LSI与HIPRA差异显著(P<0.05)。从猪伪狂犬病净化角度来说,3种试剂盒均可使用,但若用于猪伪狂犬病诊断或了解群体猪伪狂犬病毒野毒感染程度则宜采用HIPRA或IDEXX试剂盒。在实际应用中除选择合适的试剂盒外还应注意检测数据的科学分析。     

闽北地区猪伪狂犬病抗体检测分析

为了解猪伪狂犬病在闽北地区的流行情况,整理并分析2015年度血清抗体检测数据。采用ELISA检测方法对闽北地区45个规模化猪场进行检测分析,通过检测样品血清中伪狂犬病gE抗体和gB抗体的水平进行结果判定。结果显示：送检的45个规模化猪场,伪狂犬病gE抗体阳性场达25个,猪场阳性率达55.6%;共检测1304份血清,其中伪狂犬病gE抗体阳性213份、可疑24份、阴性1067份,抗体阳性率达20.6%。从伪狂犬病gE抗体阴性猪场抽检猪伪狂犬gB抗体380份,gB抗体阳性258份,猪群伪狂犬病抗体保护率仅有67.9%。     

应用ELISA双抗体夹心法检测＼猪细小病毒抗原的研究

研究建立了从胎猪脏器中检测猪细小病毒（ＰＰＶ）抗原的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法。试验方法的最侍工作条件为，抗体浓度１：４００，酶标抗体浓度１：５０。５４份胎猪样品阳性检出率为５９．３％，不同脏器的阳性检 出率分别为，心３６．４％、肝脏７２．２％、肺脏６６．７％、肾脏６６．７％。     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪的一种急性、高度传染性肠道疾病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究以纯化的PEDV 为包被抗原,通过优化 ELISA 反应条件,建立了间接 ELISA 抗体检测方法,其反应条件为：抗原最佳包被浓度为 20 μg/mL,血清标准品最佳稀释度为 1：500,包被时间为4℃过夜,5%小牛血清37℃封闭1 h,二抗 1：10 000稀释,37℃作用1 h,抗体临界值为 D_{450 nm}≥ 0.289判为阳性,D_{450 nm}≤ 0.236判为阴性,介于二者之间为可疑。检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、细小病毒和口蹄疫病毒标准血清抗体均为阴性,重复试验变异系数均小于10%,对江苏、江西、福建、广东地区74份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达84%,表明该方法具有较好敏感性、特异性和重复性,可用于 PEDV 抗体检测和流行病学调查。     

Establishment of Indirect ELISA Detection Method for Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Porcine epidemic diarrhea (PED) is an acute, highly contagious enteric disease of pigs. Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is the causative agent of PED. PED has caused significant economic losses to the pig industry. In this study,the purified PEDV as the coating antigen, by optimizing the ELISA reaction conditions,the indirect ELISA antibody detection method was established. The optimized reaction conditions were as follows: Antigen working concentration was 20 μg/mL; Serum sample dilution was 1:500;It was coated at 4℃ overnight; The plates were blocked by 5% calf serum incubated at 37℃ for 1 h; The secondary antibody was diluted at 1:10 000,incubated at 37℃ for 1 h. It was judged as positive when the cutoff value D_{450 nm}≥0.289,as negative when D_{450 nm}≤0.236,and as suspicious between 0.289 and 0.236.It could not react with the positive sear of other six viruses such as porcine respiratory and reproductive syndrome virus,porcine circovirus 2, classical swine fever virus, porcine parvovirus,pseudo rabies virus and foot-and-mouth disease virus. The variation coefficient of repeated test was less than 10%.74 pig serum samples from Jiangsu, Jiangxi, Fujian and Guangdong were detected,and the positive rate was 84%.It indicated that this method could be used for PEDV epidemiological surveys and diagnosis in the future.     

一种猪圆环病毒Ⅱ型ELISA检测试剂盒的临床应用

本研究通过采用猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒,对河北、山西两地共441份猪血清样品进行检测发现：河北保定地区349份血清样品中阳性样品为306份,感染率为87.68%;山西地区92份血清样品中阳性样品为77份,感染率为83.7%。与标准的间接免疫荧光检测法进行比较,发现相对于标准IFA,该ELISA检测试剂盒的诊断敏感性为95.48%(383/398),诊断特异性为93.02%(40/43),总符合率为95.24%。由此表明该试剂盒是一种简便、快速、灵敏、适于大规模临床应用的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒。     

猪流行性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立

为检测猪血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体水平,以纯化的PEDV作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了检测PEDV血清IgG抗体的诊断方法:当血清OD_(450nm)值0.31时,判定阳性;当OD_(450nm)值小于0.26时,判定阴性;当OD_(450nm)值介于两者之间判定可疑。结果表明,试验建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中猪流行腹泻病毒抗体、监测猪流行腹泻病的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。     

猪抵抗素（resistin）ELISA检测方法的建立

用纯化的可溶性重组resistin蛋白免疫健康家兔，制备抗血清，优化ELISA各反应条件（如工作浓度、温育时间、特异性试验），初步建立了检测猪resistin蛋白的间接ELISA方法。结果表明抗原、抗体最佳工作浓度为1∶200和1∶400，resistin最低检出限量为193.75 ng/ml；抗原和一抗、一抗和二抗的最适温育时间均为60 min。本试验建立的ELISA方法，具有灵敏度较高，特异性较好的特点，可作为猪组织和血清中resistin蛋白的检测方法。     

猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)VP1重组蛋白为包被抗原,建立了检测EMCV血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA).经优化,获得间接ELISA的最佳反应条件为抗原包被浓度0.625 μg/mL,待...     

ELISA对猪场PCV-2血清抗体的检测

应用酶联免疫吸附试验(ELISA)对三个猪场的89份血清样本进行猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)血清抗体的检测，本次检测PCV-2的总阳性率为2．24％。在甲猪场的48份血清中检出猪PCV-2阳性2份，4份可疑，阳性率为4.17％；而乙、丙两猪场的血清样本均呈阴性。结果表明：甲猪场可能有猪PCV-2的存在，而乙、丙两猪场尚处于未被猪圆环病毒污染的状态。     

Prokaryotic Expression and Development of an Indirect ELISA Detection Method of Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus N Protein

In the study,the recombinant expression plasmid pET28a-TGEV-N was constructed,and expression and purification of the TGEV N protein was completed.Through SDS-PAGE and Western blotting analysis,the N protein could be identified by transmissible gastroenteritis virus (TGEV) positive serum.Using the TGEV N protein as diagnosis antigen,we established an indirect ELISA method for detecting TGEV serum antibodies.The coefficients of variation of intro-batch and inter-batch duplicability test were less than 5%.The specificity was 100%,and the rate of false positive and the false negative rate were 0 and 5%,respectively.No cross reactions with seven porcine diseases positive serum were detected.Using this method,the clinical serum samples were detected.The results showed 100% coincidence rate compared with neutralization test.The method could detect TGEV antibody quickly and effectively,and had good repeatability and specificity,which laid the foundation for the development of standardized diagnostic kits.     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白原核表达和间接ELISA检测方法的建立

试验构建了pET28a-TGEV-N重组表达质粒,完成TGEV N蛋白的表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,表明表达产物N蛋白可被猪TGEV阳性血清识别。用TGEV N蛋白作为诊断抗原,建立了检测TGEV血清抗体的间接ELISA检测方法,该方法批内、批间重复试验变异系数均小于5%;检测血清的特异性为100%,假阳性率为0,假阴性率为5%,与7种常见猪病血清无交叉反应。针对临床血清,用该方法检测结果与中和试验结果相比,符合率为100%。该方法能够快速、有效地检出TGEV抗体,重复性和特异性好,为标准化诊断试剂盒的开发奠定了基础。