F18+ETEC分离株的鉴定·菌毛蛋白提取及生物活性验证

[目的]探讨F18+ETEC分离株的鉴定、菌毛蛋白的提取及菌毛蛋白生物活性的初步验证。[方法]分别以分离株A20、D20为模板进行PCR扩增,用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。采用热抽提法分别提取F18标准株和分离株A20、D20的菌毛蛋白,并分别制备弗氏佐剂苗,免疫产蛋鸡,采用间接ELISA法定期检测母鸡的IgY和血清抗体效价。[结果]采用TSB培养基,37℃摇床培养24 h,分离株和标准株菌毛均获得了良好的表达。分离株A20、D20经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、SDS-PAGE方法鉴定均为F18+ETEC。F18ab分离株和标准株的菌毛对产蛋鸡均具有良好的免疫原性,卵黄中IgY效价最高可达1∶25 600,血清中抗体效价高于卵黄中IgY效价,最高可达1∶51 200。[结论]分离株A20、D20均为F18+ETEC,且对产蛋鸡均具有良好的免疫原性。     

鸡抗奶牛Y精子蛋黄抗体的制备

用洗涤后的奶牛Y精子与免疫佐剂1∶1混合,免疫产蛋母鸡,收集免疫蛋,用水稀释法进行卵黄抗体(YAb)的分离,对提取的YAb用奶牛Y精子进行滴度测定,并对提取样品进行抗体含量、得率以及提取前后抗体效价损耗率进行测定.结果表明:卵黄中含有与奶牛Y精子作用的有效抗体(IgY),并且能使精子发生凝集现象；水稀释法提取后抗体得率为88.38％,抗体效价损耗率为12.49％.该抗体对Y精子作用的专一性有待进一步研究.     

嗜水气单胞菌Aer毒素和胞外蛋白酶卵黄抗体的制备

为克服嗜水气单胞菌不同血清型对卵黄抗体免疫保护效果的影响,从嗜水气单胞菌中提取其主要致病因子Aer毒素和胞外蛋白酶(ECPase),验证其生物学活性,分别免疫蛋鸡。用辛酸-硫酸铵法粗提卵黄抗体,用间接ELISA法测其效价、鉴定抗体与不同来源嗜水气单胞菌主要致病因子的交叉反应。结果表明,抗Aer毒素和抗ECPase卵黄抗体效价最高分别可达1∶213和1∶212,与其他来源嗜水气单胞菌交叉反应性强。     

抗家蚕NPV免疫卵黄抗体的制备

将家蚕核型多角体病毒用离心法进行分离和提纯,用纯化的NPV病毒粒子与福氏完全佐剂混合作为抗原注射免疫用母鸡,获得免疫卵黄抗体,用玻片双向免疫扩散法测定其效价最高为1:320.并对其进行了初步的养蚕安全性及预防效果试验,结果表明卵黄抗体在家蚕上使用安全,并且对家蚕血液型脓病有预防效果.     

奶牛血清及乳汁中抗鸡IBD抗体的研制

采取不同免疫方法，对不同采样时期的血清及乳汁进行鸡 Ｉ Ｂ Ｄ抗体效价检测，筛选出以 Ｉ Ｂ Ｄ弱毒苗加油乳苗同时接种，２ 次免疫的方法制得的血清及乳汁中抗体效价较高，血清效价最高可达１∶６４，乳汁中抗体效价最高可达１∶３２。此结果为研制乳汁抗 Ｉ Ｂ Ｄ抗体奠定了基础。     

抗豪猪大肠杆菌卵黄抗体的制备

采用甲醛灭活的仔豪猪腹泻大肠杆菌为抗原,免疫健康140日龄桃源蛋鸡,刺激机体反应生成血清抗体和卵黄抗体,并采用平板凝集试验检测抗体效价,研究获得含有高效价血清和高免蛋的最佳条件。结果表明,双翼下静脉注射10~(12)CFU/mL大肠杆菌悬浮液的最佳免疫剂量为1 mL/次。在大肠杆菌悬液中添加等量的完全福氏佐剂对免疫应答加强的程度最高。强化免疫程序能大大加强产蛋母鸡的免疫应答强度,其中初免后,每周强化免疫1次,连续4次,效果最好。无菌检测及动物安全性试验表明,制备的卵黄抗体安全可靠。制备的卵黄抗体效价和血清抗体效价变化幅度小、稳定性好、持续时间久,为临床上防治仔豪猪腹泻大肠杆菌病提供了新的手段。     

抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的制备及保护效果

从发病的暗纹东方纯体内分离、鉴定了一株致病性嗜水气单胞菌,测定其毒力,命名为NT-1.以NT-1为抗原,免疫28周龄的罗曼蛋鸡,用水稀释脱脂处理,聚乙二醇(PEG)一步法制备高效价的卵黄抗体.微量凝集试验、ELISA检测其效价及特异性:不同浓度卵黄抗体的粗提液与NT-1菌液混合注射ICR小鼠,检测特异性卵黄抗体的抑菌效果.结果表明,微量凝集试验测得的特异性抗体效价达1:16以上,ELISA效价达1:12 800以上;高效价、特异性的卵黄抗体可维持90 d,特异性卵黄抗体EUSA效价达1: 640时对感染NT-1的ICR小鼠的保护率达到了100%.     

卵黄琼扩检测鸡传染性法氏囊病抗体初报

以卵黄代替血清进行琼扩试验，对两个父母代鸡群所产种卵的检测结果表明，氯仿处理后的卵黄抗体效价与血清效价符合率最高，从而证实卵黄琼扩试验是检测鸡传染性法氏囊病抗体水平的有效手段     

免疫鸡血清与卵黄中EDS-76抗体水平比较

分别采取接种前和接种后的36只处于产蛋期的试验鸡血液分离血清及收集鸡蛋提取卵黄。卵黄分别用16%NaCl、8%柠檬酸钠和氯仿处理后,与血清一起检测减蛋综合症(EDS-76)病毒间接血凝抑制(HI)抗体。试验结果表明,血清HI抗体效价和卵黄HI抗体效价具有较好的一致性。由卵黄代替血清检测减蛋综合症HI抗体效价,作为鸡群诊断,免疫水平评估和疫苗质量评价的手段是可行的,在减蛋综合症防制中具有实际意义。     

抗番鸭细小病毒卵黄抗体的制备

[目的]有效预防和治疗番鸭细小病毒病。[方法]用番鸭细小病毒连续免疫产蛋母鸡3次,收集鸡蛋,并制备出高免卵黄抗体。通过琼脂扩散试验对制备的卵黄抗体进行效价测定,用雏番鸭进行中和与治疗试验。[结果]制备的卵黄抗体琼扩效价达到1∶32,能有效中和番鸭细小病毒对雏番鸭的致病性,对发病的雏番鸭有很好的治疗作用。[结论]该研究为番鸭细小病毒的预防和治疗提供了一种有效的生物制品。     

猪细小病毒PPT1株免疫原性研究

用PPT1株制备猪细小病毒油乳剂灭活疫苗,并将其与市售灭活疫苗免疫豚鼠,定期采集,血清用血凝抑制试验测定抗体效价。试验结果表明,PPT1株在PK-15细胞上病毒增殖效价可达到1.96×106TCID50/mL,两种疫苗二免后14d,抗体效价均可以达到8log2。     

草鱼的体液免疫应答及抗体产生细胞

以草鱼出血病病毒和牛血清白蛋白（ＢＳＡ）为抗原妆种草鱼,比较了草鱼对两种抗原的体液免疫应答情况。结果显示,在接种了ＢＳＡ的草鱼中,１４ｄ后检测至抗体,其效价在２８ｄ达到峰值;而接种了出血病病毒的草鱼,在２１ｄ后检测到抗体,抗体效价在３５ｄ达到峰值。用ＦＴＴＣ－ＢＳＡ检测免疫ＢＳＡ草鱼的抗体产生细胞,探讨了抗体产生效价与抗体细胞数量的关系。     

重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗免疫SPF鸡、SPF鸭后抗体消长规律分析

为了解重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1,Re-6株+Re-4株)的免疫效果,为临床上制定合理的禽流感疫苗免疫程序提供依据,选取3个企业生产的12批疫苗,免疫SPF鸡、SPF鸭,跟踪至免疫后24周,每3周采血检测Re-6、Re-4 HI抗体效价。结果表明:SPF鸡、SPF鸭分别在免疫后6周和3周Re-4、Re-6抗体即可达到高峰值,随着时间的推移,抗体水平逐渐下降;SPF鸡抗体的高峰值高于SPF鸭;SPF鸡的高抗体水平的维持期长于SPF鸭;3个企业的疫苗均有良好的免疫效果。     

仔猪水肿病多价油乳剂灭活菌苗在猪体内的免疫原性研究

用自制的仔猪水肿病多价油乳剂灭活菌苗肌肉注射20日龄未接种同类疫苗的长杂健康仔猪，14d后用攻毒菌株（湖北地方分离株及O138、O139、O1413个菌株）攻毒。结果表明每头免疫剂量为0.50mL(含30亿CFU）免疫效果最好，免疫2周后血清抗体几何凝集效价为1:640，保护率达到100%。     

鸡大肠杆菌1型菌毛单克隆抗体的研制

将菌毛化的大肠杆菌C600（fim^ ）经0.3%甲醛灭活后作为免疫原，经淋巴细胞杂交瘤技术，用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选获得1F4－1和2C32株抗F1菌毛a或b因子抗原单抗和1株抗F1c因子抗原单抗，它们均为IgG1。免疫印迹试验结果表明：3株单抗均能同禽大肠杆菌1型菌毛反应，识别分子质量为17ku左右的菌毛蛋白。同时对沙门氏菌及猪源大肠杆菌进行检测，结果均无交叉反应性，说明禽病原性大肠杆菌F1菌毛与沙门氏菌1型菌毛及猪大肠杆菌粘附素之间存在很大差异。     

禽流感油乳剂灭活疫苗的研制及应用

采用分子生物学技术,用陕西省部分地区自然发病鸡群分离鉴定的AIV毒株,按不同的抗原含量研制成AIV的双价油乳剂灭活疫苗进行质量检验和安全试验。结果表明:该灭活疫苗符合兽药生物制品规程的要求;免疫易感鸡后3～5 d出现HI抗体,14 d达1:128以上,21～30 d达到高峰(1:1024),并维持3～6个月(1:256);用同源AIV毒株攻毒,5 d产生保护力,7 d达100%(5/5),保护期为9个月;疫苗4℃保护期暂定12个月。区域性免疫试验,免疫后第14 d抽血检验HI滴定在(1:128)以上。使用安全,效果可靠。     

鸡志贺氏菌多价凝集抗原及其标准血清的研制

利用鸡鲍氏志贺氏菌和鸡痢疾志贺氏菌制备多价凝集抗原,确定其最佳反应浓度及比例.选择合适的试验鸡只,用2种鸡志贺氏菌灭活疫苗定期肌肉注射免疫和抗体效价测定,适时采血分离血清.结果显示,鸡鲍氏抗原与痢疾抗原的最佳混合浓度为6×10~9mL~(-1),最佳比例为1:1.制备的鸡鲍氏和鸡痢疾志贺氏菌多价阳性血清,经抗体效价测定均达6log2,阴性血清与鸡志贺氏菌多价凝集抗原作用无凝集现象出现.研制的多价凝集抗原及其标准血清经特异性试验、重复性试验和保存方法试验,具有特异性强、敏感性高、重复性好、易保存等特点,且可省去单价凝集抗原繁琐的检测程序和时间.     

牛乳铁蛋白直接竞争ELISA检测法的建立

[目的]建立一种检测牛乳铁蛋白(LF)含量的竞争ELISA检测方法。[方法]制备鼠抗牛LF单克隆抗体,采用直接竞争ELISA测定酶标记物效价,建立牛LF的直接竞争ELISA检测方法。[结果]纯化后,制备的鼠抗牛LF单抗效价达1∶1 280 000,且鉴定为IgG1。该单抗对牛乳铁蛋白具有很强的特异性。制备酶标单抗的效价为1∶640 000。抗原包被物和酶标单抗的最适工作浓度分别为1.0μg/ml和1∶40 000。抗原用碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)包被先在4℃过夜、再37℃放置2 h的效果最好。采用2%牛血清白蛋白作为封闭剂的效果最好。在31.25~1 000 ng/ml浓度范围内,牛乳铁蛋白的logit(B/B0)与牛乳铁蛋白浓度的对数值呈显著的线性关系,其回归方程为y=-1.899 1x+5.043 3(R2=0.987 3)。[结论]该研究为研制用于奶牛乳腺炎诊断的牛LF检测试剂盒奠定基础。     

谷胱甘肽转移酶标签蛋白单克隆抗体的制备

以纯化的谷胱甘肽转移酶标签蛋白(GST)免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,用纯化的GST筛选,最终获得一株抗GST的杂交瘤细胞系(命名为1D10),染色体平均记数为90对,间接ELISA检测1D10细胞培养上清的效价为1:4 000。腹水效价为1:5×107,该单抗可以特异识别GST蛋白和带有GST标签(GST-tagged)的融合蛋白。     

分泌抗BVDV McAb杂交瘤细胞株的建立

用牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）感染ＭＤＢＫ细胞,将感染细胞培养物冻融后离心取上汪经ＰＥＧ沉淀浓缩抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取血清抗体效价高遥免疫鼠的脾细胞与ＳＰ２／Ｏ细胞在ＰＥＧ作用下融合,产生杂交瘤细胞,用间接ＥＬＩＳＡ法检测杂交瘤细胞生长孔上清,筛选阳性杂交瘤细胞株。以有限稀法克隆２－３次,得到８ 泌抗ＢＶＤＶ的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞株。８株ＭｃＡｂ对ＢＶＤＶ,猪瘟均呈阳性反应。杂交