PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR法检测 转基因植物外源基因拷贝数的差异分析

探讨TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR 2种方法检测转基因植物外源基因的拷贝数方法的差异。以12株T0转基因水稻为材料,分别用TaqMan与SYBR Green实时定量PCR法检测其拷贝数,然后用SAS 9.1软件对2种方法的结果进行t检验分析。通过SAS对2组数据的t检验分析,在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green与TaqMan探针法的结果接近,差异不显著;当内参基因与目的基因扩增效率差异明显时,SYBR Green与TaqMan探针法差异显著。在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green法测定转基因植物外源基因的拷贝数时结果接近TaqMan探针法。     

Comparison of Two Real-time PCR Technigues for Quantification of GMO Contents in Highly Processed Products of Soybean

The RR soybean was quantitatively detected by ABI Prism 7300 sequence detector with PCR primers and fluorescence probes were designed according to the sequences of endogenous Lectin gene and exogenous CP4-EPSPS gene, and the PCR systems were based on SYBR GreenΙand TaqMan. The standard curve of °Ct between CP4-EPSPS gene and Lectin gene of the RR soybean in standard materials was generated and a linear regression equation was obtained. Quantification methods were optimized through two different real-time PCR chemistries, i.e. SYBR GreenΙand TaqMan, and the RR soybean contents were quantified in five standard samples and seven highly processed products by the two assays. Both methods are proved to be specific, highly sensitive and reliable for both identification and quantification of soybean DNA. The results indicate that the two optimized PCR system can be used for the practical quantitative detection of RR soybean in highly processed products.     

SYBR Green实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数

采用SYBR Green I real-time PCR方法检测转基因大豆中外源基因35S边界基因的拷贝数,以大豆凝集素基因(Lectin)作为内参照基因,以转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,初始浓度为0.43μg·μL-1,进行5倍梯度稀释得到内参照基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线:y=-2.9915x...     

SYBR~ GreenI实时PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

利用特殊性引物,应用SYBR Green I实时PCR技术鉴定检测了商业化种植的转基因油菜RT73品系。结果表明,应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为(80.2±0.5)℃,而对其他油菜品系则检测不到荧光信号。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分了特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法。     

实时荧光定量PCR检测犬GAPDH基因

建立犬3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的qPCR检测体系,为犬功能基因mRNA水平的定量分析提供有用的方法学基础。对反应体系进行优化,建立了基于SYBR GreenI染料技术的real-time PCR方法。结果表明,其标准曲线相关系数达到0.999,扩增效率为105.8%,熔解曲线为特异性单峰,组内变异系数（CV%）为0.25-2.8,组间变异系数（CV%）为1.31-2.85。该研究所建立的荧光定量RT-PCR法灵敏、稳定、高效,为犬GAPDH基因作为内参基因用于犬相关基因定量表达分析奠定了基础。     

利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数

[目的]探讨SYBR Green实时定量PCR技术应用于检测转基因植物外源基因拷贝数的可行性。[方法]使用SYBR Green实时定量PCR技术,以转CYCD3;1的拟南芥为材料,通过CYCD3;1基因与单拷贝内参基因以及转基因株系中的CYCD3;1基因与野生型植株的比较来确定外源基因的拷贝数。[结果]该法计算所得外源基因拷贝数与传统高准确性的Southern blot法结果相符。[结论]使用该法检测外源基因拷贝数简单易行,可操作性强。     

奶牛隐孢子虫SYBR Green Real-time PCR检测方法的建立

为建立一种方便快捷的检测奶牛隐孢子虫的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,根据GenBank中已发表的隐孢子虫18s rRNA基因设计一对引物,并以从卵囊中提取的DNA为模版,初步建立了检测奶牛隐孢子虫的SYBR Green Real-time PCR方法,进而对采集的奶牛粪便进行了特异性、敏感性和重复性检测。结果显示,本研究建立的Real-time PCR方法敏感性高,最低检测阈为10个拷贝的质粒DNA和1g粪便中的10个卵囊,扩增产物的特异性良好,重复性试验的标准差为0.494,重复性良好。研究表明,建立的Real-time PCR快速、特异、敏感,可用于奶牛隐孢子虫病的流行病学调查。     

抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测研究

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNA SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术，扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因。绘制2种基因扩增的循环数一拷贝数标准曲线图，根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量；并作重现性和熔解曲线分析。结果表明，lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好，R^2值分别达到0．9997和0．9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示，实测值与实际值接近，相对偏差5％～11％。SYBR Green I实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。     

利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数

[目的]探讨SYBR Green实时定量PCR技术应用于检测转基因植物外源基因拷贝数的可行性。[方法]使用SYBR Green实时定量PCR技术,以转CYCD3;1的拟南芥为材料,通过CYCD3;1基因与单拷贝内参基因以及转基因株系中的CYCD3;1基因与野生型植株的比较来确定外源基因的拷贝数。[结果]该法计算所得外源基因拷贝数与传统高准确性的Southern blot法结果相符。[结论]使用该法检测外源基因拷贝数简单易行,可操作性强。     

TRIM21基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

三基序蛋白21（TRIM21）与癌症、肿瘤及固有免疫等密切相关。为了快速检测TRIM21基因的表达，根据Genbank中公布的TRIM21基因序列设计引物，通过常规PCR扩增该基因后克隆至pMD-18T载体上，测序并鉴定正确后制备重组质粒，以pMD-18T-TRIM21重组质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。采用重复性、特异性及灵敏性等试验，成功建立了检测TRIM21基因的荧光定量PCR检测方法。结果显示，该方法灵敏度高，最低检测下限为37.7 copies·μL?1，比普通PCR高出10倍。在3次独立的试验中，组内和组间变异系数较小，具有较高的可重复性，同时，还能检出不同细胞中TRIM21的表达。因此，该荧光定量方法可为TRIM21的检测及临床研究提供技术支持。     

交配和黑光灯处理对棉铃虫Helicoverpa armigera生物钟基因cryptochromes mRNA表达的影响

[目的]明确交配和黑光灯处理对棉铃虫生物钟基因cryptochromes mRNA表达的影响。[方法]应用实时定量PCR（SYBR Green）技术检测不同条件下棉铃虫cryptochromes（cry1和cry2）基因的表达。提取棉铃虫头部总RNA,经DNase I消化后进行反转录合成cDNA,并采用特异性引物分别对cry1、cry2和EF-1α基因进行实时定量PCR扩增。[结果]黑光灯处理棉铃虫2h,其cry1mRNA的表达量明显降低;cry2mRNA的表达量小于对照,但两者之间差异性并不显著。交配对棉铃虫cry1和cry2mRNA表达均存在显著影响,并且雌、雄两性cry1和cry2mRNA表达量在交配后随时间延长呈下降趋势。[结论]该结果对进一步研究cry基因的功能以及棉铃虫防治具有重要意义。     

转基因水稻深加工产品两种荧光定量方法的比较研究

根据转基因水稻中外源基因Cry1A(B)和内源基因SPS设计SYBR Green I引物、TaqMan引物和荧光探针,以内源基因SPS作为内参照,使用两种FQ-PCR方法对水稻深加工产品中转基因水稻的含量进行定量检测.建立了转基因水稻标准品Cry1A(B)和SPS之间的△Ct与样品中转基因水稻含量百分比之间的校正曲线和...     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和8NS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因B—actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18－T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β—actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R^2均在0．99以上;最小检出量为10拷贝／μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。     

SYBR Green Ⅰ荧光检测痕量宿主DNA

基于SYBR Green Ⅰ荧光染料与双链DNA结合产生荧光的原理,建立一种痕量DNA荧光检测方法.采用不同稀释倍数的SYBR Green Ⅰ荧光染料做DNA的标准曲线,确定SYBR Green Ⅰ荧光染料的最佳稀释倍数.比较荧光法和Southern blotting杂交法定量DNA.结果表明,SYBR Green Ⅰ...     

鸡IL-6、IL-17和IFN-γ实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立针对鸡白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）和γ干扰素（IFN-γ）的实时荧光定量PCR检测方法,为细胞因子的定量检测及病毒致病机制的研究奠定基础.[方法]根据GenBank已发表的鸡IL-6、IL-17、IFN-γ和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因保守序列,设计并合成4对相应的特异性引物,以鸡胚成纤维细胞的cDNA为模板构建重组质粒,对退火温度、引物浓度等SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应条件进行优化,建立各基因的标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性试验.[结果]GAPDH、IL-6、IL-17和IFN-γ的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增效率分别是98.2％、99.2％、102.0％和100.8％,相应的标准误差为0.00666、0.00813、0.00365和0.00458.特异性试验结果显示各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰,敏感性试验结果表明各基因的检测下限均为100拷贝,重复性试验结果表明组内变异系数均小于2.00％.[结论]建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、特异性强等特点,为快速检测和定量鸡源IL-6、IL-17和IFN-γ的表达水平提供了技术平台.     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR （RT-PCR）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

荧光定量PCR技术检测花生种皮抗黄曲霉基因表达强度

依据已获得的基因芯片和cDNA研究结果,筛选上调表达并且表达差异系数在5.0以上的花生种皮基因序列设计引物,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法对上述基因进行相对定量分析,以验证基因芯片研究结果并为分离黄曲霉抗性相关基因奠定基础。结果表明:荧光定量PCR的结果与基因芯片的结果高度一致,目的基因在感病和抗病品种之间差异显著,其中BE87、AW03在抗病品种中相对表达量较高,可能在抵御黄曲霉侵染过程中发挥重要作用。     

广西三黄鸡PPARγ谨因克隆及实时荧光定量PCR的建立

【目的】克隆广西三黄鸡过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因,建立该基因的实时荧光定量PCR,为后续开展广西三黄鸡PPARγ基因组织表达谱及品种间表达差异研究奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的鸡PPARγ基因序列保守区域,用Oligo6．0软件设计合成1对引物,以广西三黄鸡脂肪总RNA为模板,用RT-PCR从广西三黄鸡克隆PPARγ基因。以携带PPARγ基因片段的重组质粒为标准品,建立基于SYBR GreenⅠ染料法的实时荧光定量PCR标准曲线。【结果】广西三黄鸡PPARγ基因的编码区序列（CDS）长1428bp,编码475个氨基酸;与GenBank已公布的鸡PPARγ基因（AF163811）参考序列比对,其同源性为99．7％,存在4个位点碱基突变,但均为无义突变。广西三黄鸡PPARγ基因的实时荧光定量PCR标准曲线方程为：y=-3．568x＋28．50,扩增效率为1．907,实时荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线峰单一。【结论】鸡PPARγ基因在进化中比较保守;建立的广西三黄鸡PPARγ基因实时荧光定量PCR是可行的。     

SYBR Green I 实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一,早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂,而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测,研究旨在建立小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的SYBR Green I实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin序列,设计1对特异性引物,建立并优化SYBR Green I real-time PCR反应体系,利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌（R. solani）、双核丝核菌AG-A和AG-F菌株、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）和禾谷镰孢（F. graminearum）等8种小麦根部或土壤病原物的菌丝DNA进行普通PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测接种后5、10、60 d不同接种浓度的盆栽小麦病株。【结果】研究设计的引物特异性强,普通PCR检测结果仅小麦纹枯病菌DNA有扩增条带。Real-time检测结果表明该对引物对小麦纹枯病菌只有唯一的产物吸收峰,对其余供试菌株均未检测到荧光信号。普通PCR检测的灵敏度为6.5×10³ copies/μL, real-time PCR的灵敏度可达到6.5×10² copies/μL。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的real-time PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,相关系数为0.997,扩增效率为0.91。对人工接种的盆栽小麦病株进行real-time PCR检测,结果表明与病情指数和接种量分别呈显著正相关。【结论】研究建立的基于real-time PCR技术的小麦纹枯病菌快速检测方法速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好。可以用于小麦纹枯病菌检测、指导病害预测和防治。