应用Cre/loxP系统在转化细胞水平上高效删除转基因水稻的标记基因

 研究了Cre/loxP系统在转化细胞水平上删除转基因水稻中抗性标记基因的可行性和效率。采用农杆菌介导法将Cre/loxP标记基因剪切系统载体pNCG导入水稻细胞,用G418筛选法获得水稻抗性愈伤组织后,在组织培养不同阶段的培养基中添加25 μmol/L雌激素进行Cre基因的诱导表达和标记基因的剪切,PCR检测T0植株中标记基因nptⅡ、重组酶基因Cre和目标基因gusA的整合情况。将扩增结果为gusA（+）/nptⅡ（-）/Cre（-）的转基因植株统计为标记基因剪切成功的植株。结果表明,在抗性愈伤组织培养的预分化前、预分化和分化阶段添加雌激素诱导表达重组酶Cre均能成功切除标记基因序列,标记基因剪切成功率为6.82%~46.43%。在预分化前采用液体培养基添加雌激素诱导处理愈伤组织3 d,T0植株中标记基因的剪切效率高达173.33%,主要原因是雌激素处理提高了愈伤组织绿苗分化率。直接在分化培养基中添加雌激素诱导处理,T0植株中标记基因剪切成功率达46.43%,剪切效率（144.44%）也较高。表明雌激素诱导的Cre/loxP系统能在水稻抗性愈伤组织水平上实现对标记基因序列高效快速删除。     

一种水稻香味基因功能标记的开发

为了提高水稻香味基因的分子标记辅助选择的准确性,根据水稻隐性香型品种与非香型品种的BAD2基因（即香味基因）序列之间存在8 bp碱基缺失,设计出香味基因fgr的InDel功能标记GRFM04。利用该标记对粤丰B（香型）/振丰B（非香型）的F2分离群体和其他16份香稻品种和6份非香稻品种进行检测验证。依据其PCR扩增产物电泳带型,可以准确地区分出香型纯合基因型、非香型纯合基因型和杂合基因型3种带型,且3种带型与其植株或品种相应的香味性状表现完全呈一一对应关系。     

ZmC4Ppc基因水稻的标记辅助选择及其后代的产量性状分析

ZmC4Ppc基因全长6781bp，PCR扩增时带型不清晰。重复性差，影响标记辅助选择的准确性。通过序列比对找到了该基因在玉米上存在而在水稻上不存在的特异片段，利用PrimerPremier5．0设计了1对用于水稻标记辅助选择的特异性引物（前引物为5’AAGCAGGGAAGCGAGACG3’，后引物为5‘GATTGCCGCCAGcAGTAG3＇，命名为MRpc）。结果表明。经MRpc筛选的该基因在各生育阶段都能高效表达，且为组成性表达。对标记辅助选择后代FPM881进行了遗传背景、PEPCase活性、净光台速率、一般配合力（GCA）和特殊配合力（SCA）分析。FPM881与对照的遗传背景相似度已达95％以上，ZInC4Ppc在MAS的各世代中能够高效表达。GCA和ScA分析结果表明从FPM881中能够筛选出单株产量、有效穗和千粒重优于对照、GCA较高的改良恢复系并得到SCA显著高于对照的杂交组合。试验结果说明，ZINC4Ppc基因高效表达能提高经济产量，在水稻遗传背景中发挥其基因效应。     

不同转化方法培育无抗性选择标记转基因水稻效率的比较

 为研究不同的转化方法培育无抗性选择标记转基因水稻的效果,以4个籼粳稻品种为受体材料,比较了用农杆菌介导的双菌双载体和双T DNA单载体两种共转化技术的共转化频率及随后获得的无抗性选择标记基因转化子的效率。结果表明,在双菌双载体介导的转化中,4个水稻品种的平均共转化频率为10.1%,其中55.6%的共转化植株自交后代中可筛选出无抗性选择标记的转基因水稻植株。在单载体双 T DNA介导的共转化中,平均共转化频率为45.0%,从其中600%的共转化植株自交后代中可获得无抗性选择标记的转基因植株,即双T DNA单载体法的去选择标记的效率（270%）要较双菌双载体法（5.6%）高。     

水稻广谱抗瘟基因Pigm紧密连锁分子标记开发及其育种应用

根据广谱抗瘟基因Pigm精细定位结果,筛选获得共显性InDel标记DG-3在Pigm基因供体亲本谷梅4号与9个籼稻受体亲本之间存在明显且稳定的多态性。在T98B×谷梅4号和R640×谷梅4号2个组合的BC1F1群体中随机取单株进行稻瘟病抗性表型及基因型分析,结果表明,无论是田间病圃鉴定,还是室内接种鉴定,分子标记DG-3对这2个组合回交群体的抗稻瘟病表型选择效率达95%以上,说明DG-3与Pigm基因紧密连锁。在此基础上,采用分子标记辅助选择与回交育种相结合的方法,利用DG-3在9个组合的回交群体中选择含有目的基因的单株分别与相应轮回亲本逐代回交,分别获得了9个组合的BC3F1群体,为进一步连续回交定向改良轮回亲本的稻瘟病抗性奠定了基础。     

一种新的水稻香味基因功能标记的开发与应用

香味是影响稻米品质的一个重要性状,Badh2基因突变是水稻产生香味的主要原因,水稻香味产生主要有Badh2基因第2、4、5、7、8外显子突变类型,其中研究最多的是第7外显子突变类型.为了提高水稻香味性状检测的准确性、安全性和效率,本研究根据水稻Badh2基因突变(第7外显子8 bp缺失、3 bp突变)的序列设计开发了3...     

通过分子标记辅助选择技术选育携有水稻白叶枯病抗性基因Xa23的水稻株系

 通过杂交和分子标记辅助选择技术,将亲本材料18113携有的水稻白叶枯病抗病基因Xa23导入亚种间恢复系H705和优质恢复系H706。利用EST标记C189检测目的基因,在18113/H705 F3和18113/H706 F3株系中,分别获得71和52份携有Xa23纯合基因型恢复系。采用水稻白叶枯病Ⅳ型小种代表菌株浙173进行剪叶接种,分别鉴定出61和44份抗病株系,它们的分子标记辅助选择准确率分别为85.92%和84.61%。研究结果表明,C189是检测Xa23基因的有效分子标记之一,不过,其假阳性的几率高于理论交换率的现象还有待于进一步研究。     

水稻抗褐飞虱基因Bph18(t)的STS标记开发及有效性验证

利用携有Bph18(t)基因抗褐飞虱材料与感虫材料之间在抗虫位点上的单核苷酸差异,成功开发出1个STS标记KC1。该标记可以准确区分含或不含抗虫基因Bph18(t)的基因型。进一步构建扬稻6号(9311)[不含Bph18(t)基因,感褐飞虱]/C4064[携有Bph18(t)基因]的F2群体进行抗虫鉴定,同时使用KC1标记检测F2群体单株的基因型。根据分子标记检测结果与抗虫表现之间的符合程度推算出标记的选择效果达到了82.6%。研究结果表明,KC1标记有较高的目的基因选择效率,可以应用于扬稻6号遗传背景下Bph18(t)基因的分子标记辅助选择。     

分子标记辅助选择在水稻抗病虫基因聚合上的应用

 稻瘟病、白叶枯病、褐飞虱和白背飞虱是危害水稻生产的主要病虫害。实践证明,培育抗病虫品种是控制水稻病虫害最经济和有效的途径。总结了目前已报道和定位的抗病虫基因的研究和利用情况,指出利用分子标记辅助选择聚合不同类型抗病虫基因到同一品种,可以提高品种抗性、拓宽抗谱,是水稻抗病虫品种培育的发展方向。     

ZmmC4Ppc基因水稻的标记辅助选择及其后代的产量性状分析

ZmC4Ppc基因全长6781 bp,PCR扩增时带型不清晰,重复性差,影响标记辅助选择的准确性.通过序列比对找到了该基因在玉米上存在而在水稻上不存在的特异片段,利用Primer Premier 5.0设计了1对用于水稻标记辅助选择的特异性引物(前引物为5′AAGCAGGGAAGCGAGACG 3′,后引物为5′GATTGCCGCCAGCAGTAG 3′,命名为MRpc).结果表明,经MRpc筛选的该基因在各生育阶段都能高效表达,且为组成性表达.对标记辅助选择后代FPM881进行了遗传背景、PEPCase活性、净光合速率、一般配合力(GCA)和特殊配合力(SCA)分析.FPM881与对照的遗传背景相似度已达95%以上,ZmC4Ppc在MAS的各世代中能够高效表达.GCA和SCA分析结果表明从FPM881中能够筛选出单株产量、有效穗和千粒重优于对照、GCA较高的改良恢复系并得到SCA显著高于对照的杂交组合.试验结果说明,ZmC4Ppc基因高效表达能提高经济产量,在水稻遗传背景中发挥其基因效应.     

抗水稻细条病和水稻白叶枯病转基因水稻植株的获得

抗水稻细条病和水稻白叶枯病转基因水稻植株的获得ＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｉｃｅＰｌａｎｔｓＲｅｓｉｓｔａｎｔｔｏＢａｃｔｅｒｉａｌＬｅａｆＳｔｒｅａｋａｎｄＢａｃｔｅｒｌａｌＢｌｉｇｈｔｏｆＲｉｃｅ￥中国水稻研究所生物工程系和...     

转Pi-d2基因水稻对稻瘟病的抗性分析

对由pCB6.3kb、pCB5.3kb和pZH01-2.72kb三个不同表达载体转化的转稻瘟病抗性基因Pi-d2水稻株系进行稻瘟病抗性分析。结果表明,转Pi-d2基因水稻的9个高代株系对来自四川的39个稻瘟病菌株表现不同的抗性,抗病频率最高达91.7%;4个转基因早代纯合株系对来自中国农业科学院的58个菌株中的81.48%以上菌株表现抗性,具有广谱抗性特点。稻瘟病菌粗毒素筛选结果表明,来自转基因植株的幼胚愈伤组织诱导率随培养基中粗毒素浓度提高而降低,粗毒素浓度达到40%时,幼胚愈伤诱导率为49.33%,受体对照幼胚愈伤组织诱导率为5%。田间诱发条件下,转基因株系在大田的穗瘟发病率为0%～50%,抗性较受体对照大幅度提高。     

9个不同水稻品种的比较试验

[目的]筛选适宜在兴化市种植的高产优质抗逆性好的水稻品种。[方法]通过田间对比试验,对9个示范水稻品种的生育期、农艺性状、经济性状、抗逆性及丰产性进行比较分析。[结果]润禾1号生育期最短,为129 d,其他品种生育期为136~138 d;兴作1号、盐绠6号、08-49、南粳40和润禾1号产量超过7 552.50 kg/hm2;兴作1号和盐绠6号抗倒性好,成穗率偏低,08-49和润禾1号零星发生恶苗病,润禾1号零星发生基腐病。[结论]兴作1号、盐绠6号和08-49产量表现好、抗性强,可以作为兴化市示范推广品种。     

转Pi9抗稻瘟病基因水稻株系的比较转录组分析

【目的】在转录水平上解析Pi9基因介导的稻瘟病抗性调控机理,为培育抗病水稻品种提供理论依据。【方法】向水稻品种日本晴(NPB)及其转Pi9抗稻瘟病基因株系(NPB/Pi9)接种稻瘟菌。分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h提取叶组织样品,选取12503个水稻基因定制基因芯片,进行水稻基因转录组分析,并通过qRT-PCR对部分差异表达基因进行验证。【结果】NPB/Pi9在接种后12 h、24 h和36 h的基因表达量分别与其接种0 h表达量比较,共检测到7754个差异表达基因;相应地,感病水稻NPB在以上时间点共检测到7385个差异表达基因;在接种后36 h,NPB/Pi9的差异表达基因数目显著多于NPB。比较NPB/Pi9和NPB相同时间点的基因表达量,共获得4065个差异表达基因,其中接种后36 h的差异表达基因显著多于接种后0 h、12 h或24 h。因此,NPB/Pi9的稻瘟病防御反应更强烈。对NPB/Pi9与NPB相同时间点的差异表达基因进行GO和KEGG分析,细胞外区域、植物对刺激应答、转录调控、氧化还原、离子结合、次生代谢和植物激素相关的GO分类在接种后呈显著富集,苯丙氨酸代谢、类黄酮生物合成和植物激素信号途径的KEGG通路在接种后显著富集。与效应分子触发的免疫反应(ETI)相关的水杨酸信号途径、几丁质酶,以及与病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)相关的胞外区域、对刺激的应答、木质素合成等,均在抗感水稻之间差异表达。而且PTI/ETI共有的WRKY转录因子、MAPK激酶、茉莉酸和乙烯信号途径等发生差异表达。综上所述,NPB/Pi9和NPB的差异表达模式与ETI和PTI相关,两者相互联系并在Pi9介导的稻瘟病抗性中发挥作用。【结论】与日本晴比较,抗病基因型NPB/Pi9对稻瘟病防御反应更强烈。转录因子、激酶、NBS-LRR基因、几丁质酶、水杨酸、茉莉酸和乙烯信号途径,以及植物次生代谢在Pi9介导的稻瘟病抗病反应中发挥重要作用。     

水稻抗稻瘟病基因Pi-ta共显性分子标记的建立

 根据抗病基因Pi-ta和感病等位基因pi-ta在DNA序列上的单核苷酸长度多态性（single nucleotide length polymorphisms，简称SNLP）设计了3个特异性引物YL155、YL183和YL200，并分别用蓝色和绿色染料将YL155和YL183进行标记，而YL200不标记。在一个PCR反应中同时加入这3对引物，并应用ABI自动分析仪对PCR产物进行分析，结果发现，抗病基因Pi-ta纯合的样品获得一个峰值为181 bp的图谱，感病等位基因pi-ta纯合的样品获得一个峰值为183 bp的图谱，而抗病基因Pi-ta处于杂合状态的样品出现两个峰。由此建立了水稻抗稻瘟病基因Pi-ta的共显性分子标记。以杂交组合Katy/RU9101001的12个F2单株和15个水稻品种为材料，利用已建立的显性分子标记和稻瘟病菌人工接种试验对共显性标记的正确性进行了验证，结果发现三者的实验结果完全吻合，因此该共显性标记可应用于水稻抗病基因Pi-ta的分子标记辅助选择。