14-3-3ζ与肿瘤

14-3-3蛋白主要含7种亚型(β、γ、ε、η、ζ、σ和θ)。研究发现,14-3-3ζ大概主要是通过细胞增殖、细胞周期调控、信号转导等方面影响肿瘤的形成和发展过程,另外14-3-3ζ蛋白在多种肿瘤组织中表达量增加,其可能与肿瘤的形成和发展有关。     

堆型艾美耳球虫重组DNA质粒pcDNA3-3-1E的免疫原性

用E.acervulina重组质粒pcDNA3-3-1E免疫雏鸡,观察其对雏鸡细胞免疫和体液免疫功能的影响。将7日龄雏鸡随机分为4组,即空白对照组、pcDNA3.1空质粒组、重组质粒免疫组和卵囊免疫组,每组30只。pcDNA3-3-1E经肌肉注射途径免疫雏鸡,剂量为50μL/只（含质粒1g/L）。7日龄免疫1次,14日龄加强免疫1次。检测雏鸡血液T淋巴细胞增殖率,测定血清抗体水平。结果显示,与空质粒组和健康对照组相比,重组质粒组淋巴细胞的增殖能力明显增强（P〈0.05）,外周血中IgG的含量均显著升高（P〈0.05）,表明pcDNA3-3-1E裸质粒DNA能有效的提高雏鸡的细胞免疫和体液免疫水平。     

猪14-3-3蛋白家族基因生物信息学分析

14-3-3蛋白在哺乳动物中均有表达,是一类高度保守的酸性蛋白家族,广泛参与各种信号传导途径,具有十分重要的功能。本研究以猪的14-3-3蛋白家族为研究对象,运用生物信息学方法,首先对猪(Sus scrofa)14-3-3蛋白家族基因组数据库进行搜素,获得猪14-3-3蛋白家族的7个亚型。然后通过对所有的猪14-3-3蛋白家族的DNA序列及各种表达序列标签(Expression Sequence Tags,ESTs)作进一步比对分析。结果表明:猪14-3-3蛋白家族的7个亚型在猪中均有表达;蛋白质多序列匹配分析表明猪14-3-3蛋白存在多个保守结构域,在各功能区段相当保守;通过基因结构分析、ESTs表达分析和蛋白质预测分析表明,14-3-3蛋白质家族均为亲水性蛋白,且不同亚型在猪体内不同组织表达,参与不同的生物学功能。本文将为猪14-3-3蛋白家族进一步的功能分析提供研究基础。     

(3S,4S)-4-([R)-1-羰基乙基]-3-([R)-1-(t-丁基二甲基硅烷氧基)乙基]氮杂环丁烷-2-酮的合成

以4-乙酰氧基氮杂环丁酮(2)为母核,与手性合成辅助剂溴丙酰基-螺环[2H-1,3-苯并噁嗪-2,1’-环己基]-3(4H)-酮(3)进行取代反应,水解得培南类关键中间体(3S,4S)-4-([R)-1-羰基乙基]-3-([R)-1-(t-丁基二甲基硅烷氧基)乙基]-2-丙内酰胺(1),总收率约为81%~87.6%[以4-乙酰氧基氮杂环丁酮(2)计]。     

重组克柔念珠菌14-3-3蛋白诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制

旨在研究重组克柔念珠菌(Candida krusei)14-3-3蛋白(rCK14-3-3)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎性反应的分子机制，为系统研究克柔念珠菌损伤奶牛乳腺上皮细胞的机制提供理论依据。采用原核表达的方法构建克柔念珠菌BMH1基因重组质粒并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，经诱导表达纯化后进行Western blot鉴定；CCK-8法筛选rCK14-3-3蛋白对MAC-T的最适作用浓度和时间；Western blot检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T的Toll样受体、MAPK信号通路、NF-κB信号通路主要蛋白相对表达量的影响；ELISA检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T中相关炎性因子IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-12相对表达量的影响。结果显示：成功构建了pET-21a-BMH1重组表达载体，经诱导表达纯化后获得有生物学活性的rCK14-3-3蛋白，纯度达90%以上，浓度为0.2 mg·mL^-1。与空白对照组相比，采用50μg·mL^-1的rCK14-3-3作用MAC-T,TLR2、...     

小鼠脑14-3-3ζ蛋白的基因克隆及鉴定

提取小鼠脑组织总RNA,采用RT-PCR法扩增14-3-3ζ蛋白的cDNA,将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体上,并用双酶切法和PCR法对结果进行鉴定。结果显示,RT-PCR扩增出1条大小约为738 bp的特异性条带,双酶切法和PCR法鉴定结果表明,PCR产物已被克隆到pGEM-T Easy载体中。DNA测序结果表明,所克隆的DNA片段与GenBank中已收录序列一致,表明小鼠脑14-3-3ζ蛋白重组pGEM-T克隆载体构建成功。     

过量表达Fa14-3-3C促进拟南芥对低氮胁迫耐受性的研究

氮元素是植物生长发育过程必不可少的营养元素之一,对禾本科作物生长的影响更加明显。本研究采用RACE技术从高羊茅叶片中克隆获得Fa14-3-3C基因全长,并对其亚细胞定位与分子功能进行系统研究。在烟草表皮细胞中观察发现Fa14-3-3C-GFP主要定位在细胞质中与细胞膜上。将Fa14-3-3C基因在拟南芥中过量表达获得3个单拷贝转基因株系(抗性分离比为3∶1)。在低氮胁迫反应中,Fa14-3-3C过量表达株系OE-1与OE-3的根鲜重显著比野生型高,而OE-2与野生型差异不显著,通过荧光定量PCR分析发现OE-1与OE-3过量表达明显而OE-2没有过量表达,说明Fa14-3-3C对植物耐低氮胁迫调节具有剂量效应。定量观察植物根系生长发现在低氮处理早期OE-1转基因株系就显著优于野生型,主要是通过补偿根系生长的方式缓解低氮胁迫对植物的伤害。因此本研究不仅获得了耐低氮胁迫候选基因,而且验证了其在模式植物中的分子功能,为进一步通过基因工程等手段培育耐低氮胁迫种质资源奠定基础,具有重要理论研究价值与生产应用前景。     

重组酿酒酵母甘油-3-磷酸脱氢酶的诱导与纯化

为了解重组酿酒酵母GCY1基因表达甘油-3-磷酸脱氢酶的情况,以SD-URA 2%葡萄糖、3×YP+6%半乳糖、SC-URA 2%半乳糖和SC-URA2%半乳糖加5%1 M Na Cl等4种培养基诱导培养,粉碎破壁酵母,采用Profinia蛋白质全自动高速纯化,并用SDS-PAGE凝胶电泳测定分子质量。结果显示:含有GCY1基因的酿酒酵母在25℃下振动培养48 h,其OD600 nm吸光值:3×YP+6%半乳糖培养物OD值为8.75,而3×YP+2%半乳糖+5%1 M Na Cl培养物OD值为7.35。采用Profinia低压液相色谱纯化,只有3×YP+2%半乳糖+5%1 M Na Cl培养基中酿酒酵母表达甘油-3-磷酸脱氢酶,且经SDS-PAGE凝胶电泳测得分子质量为65 ku。     

鸡艾美耳球虫3-1E基因的克隆与表达

应用反转录 -聚合酶链式反应 (RT- PCR)技术 ,分别从柔嫩艾美耳球虫甘肃株 (E.tenella GS,Et GS)和堆型艾美耳球虫青海株 (E.acervulina QH,Ea QH)孢子化卵囊子孢子中提取的总 RNA扩增得到鸡球虫子孢子表面抗原 3- 1E基因 (Et GS3-1E和 Ea QH 3- 1E)。将 Et GS3- 1E与原核表达载体 p GEX- 6 P1连接 ,构建了的 p GEX- 3- 1E原核表达质粒 ,并获得融合蛋白的高效表达和纯化。序列分析表明 :Et GS3- 1E和 Ea QH 3- 1E的 ORF均为 5 13个碱基 ,共编码 171个氨基酸。Et GS3- 1E的蛋白分子量为 18.5 k D,Ea QH 3- 1E的蛋白分子量为 18.6 k D。ORF比较 ,Et GS3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 2个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.8%,有 1个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 99.4 %;Ea QH 3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 4个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 97.7%,有 3个氨基酸变异 ,氨基酸同源性为 98.3%;Et GS 3- 1E与 Ea QH 3- 1E比较 ,有 3个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.2 %,有 2个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 98.8%。获得了 Et GS 3- 1E融合蛋白的高效表达和纯化 ,表达率达 4 3.2 %。     

蚕蛹油ω-3型不饱和脂肪酸研究

由缫丝后新鲜湿蚕蛹通过酶法制取的蛹油,经气相色谱分析,不饱和脂肪酸以α-亚麻酸（C18:3ω-3　35.72％）和油酸（C18:1　ω-9 33.38％）为主;饱和脂肪酸以棕榈酸（C16:0 21.49％）为主。用冷冻分离和碱金属盐沉淀相结合的方法,使蛹油中的ω-3不饱和脂肪酸显著增加,特别是α-亚麻酸,比原来增加了一倍。蚕蛹油可作为ω-3不饱和脂肪酸的广泛来源。     

肉鸡日粮中1α-羟基维生素D_3与1,25-二羟基维生素D_3的生物学效价比较

试验旨在研究以骨骼矿化指标评估1~42日龄肉鸡日粮中1α-羟基维生素D_3(1α-OH-D3)和1,25-二羟基维生素D_3[1,25-(OH)_2-D_3]的相对生物学效价。将300只1日龄罗斯308肉鸡母雏随机分为6个处理,每个处理5个重复,每个重复10只。设计6种饲粮,在基础饲粮(钙Ca 0.50%,非植酸磷NPP 0.25%,无维生素D_3)中分别添加3个水平1α-OH-D_3(1.25、2.5、5.0μg/kg)和3个水平1,25-(OH)_2-D_3(1.25、2.5、5.0μg/kg)。结果表明:以42日龄肉鸡胫骨强度、重量、长度、直径和灰分重量为评价指标,1α-OH-D_3生物学效价分别是1,25-(OH)_2-D_3的0.78、0.77、0.93、0.91倍和0.78倍;以42日龄肉鸡股骨强度、重量、长度、直径和灰分重量为评价指标,1α-OH-D_3生物学效价分别是1,25-(OH)_2-D_3的0.76、0.84、0.95、0.88倍和0.80倍;以42日龄肉鸡跖骨重量、长度和灰分重量为评价指标,1α-OH-D_3生物学效价分别是1,25-(OH)_2-D_3的0.82、0.96倍和0.83倍。结果提示:以42日龄肉鸡骨骼矿化指标评价,1α-OH-D_3的生物学效价约为1,25-(OH)_2-D_3的0.85倍。     

细粒棘球蚴14-3-3重组抗原诱导小鼠体液免疫应答的研究

为研究细粒棘球绦虫原头蚴(Eg)重组蛋白14-3-3(r Eg14-3-3)诱导小鼠的免疫反应以及其对小鼠的免疫保护力,本研究将r Eg14-3-3免疫ICR小鼠,在三免后4周,采用原头蚴攻击感染,并采用ELISA法对小鼠血清中Ig G及其亚型、Ig E抗体水平和IL-21细胞因子水平进行检测。结果表明:免疫组小鼠血清Ig G、Ig G1、Ig G2a水平显著高于对照组(p0.05),Ig E水平则无显著性差异。免疫组小鼠和对照组小鼠在免疫后和攻击感染后IL-21水平迅速升高并在较长时间内维持相对较高水平;而且免疫组保护效率为84.47%。本研究表明r Eg14-3-3能够诱导小鼠产生高水平的特异性体液免疫反应,并且Tfh细胞也参与体液免疫应答,表明该重组蛋白可以作为预防Eg的候选亚单位疫苗或重组疫苗的有效免疫抗原。     

白刺14-3-3基因家族的鉴定及表达分析

为探明白刺(Nitraria tangutorum)14-3-3基因家族的基本特征及其进化关系,本研究基于白刺转录组数据,利用生物信息学方法,对白刺14-3-3基因家族成员进行鉴定,预测其理化性质、亚细胞定位、保守结构域,分析其系统进化关系及其基因在不同浓度盐、干旱处理下的组织器官表达模式.结果表明:从白刺转录组数据中...     

miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的作用

旨在探究miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的影响。本试验收集180日龄健康母猪的卵巢组织,每次试验取20对卵巢进行颗粒细胞的分离培养,将miR-24-3p的mimics及inhibitor转染进颗粒细胞,通过ELISA、RT-qPCR、Western blot、双荧光素酶报告试验等技术探究miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的作用。结果表明,过表达miR-24-3p可显著促进雌二醇的合成(P<0.01),并加快StAR、CYP19A1和CYP11A1的转录和翻译(P<0.05);而干扰miR-24-3p则显著抑制雌二醇的合成(P<0.05),并显著下调CYP11A1、CYP19A1的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。进一步研究发现,TOP1是miR-24-3p的直接靶基因,过表达miR-24-3p可显著抑制TOP1的表达(P<0.05),干扰miR-24-3p可显著上调TOP1的表达(P<0.05)。而过表达TOP1则可减弱miR-24-3p对颗粒细胞雌二醇合成的促进作用(P<0.05)。综上所述,miR-24-3p通过靶向TOP1...     

乳粉中1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油三酯的测定

建立乳粉中1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油三酯（1-oleic-2-palmitic-3-linoleic acid triglyceride,OPL）的气相色谱检测方法。样品经乙醚和石油醚提取,提取液浓缩近干,正庚烷定容,通过CP-TAP CB弹性石英毛细管柱分离,以氢火焰离子化检测器检测,外标法定量。结果表明：通过CP-TAP CB弹性石英毛细管柱程序升温分离,进样口温度330℃,分流进样,分流比1∶10,进样体积1.0 μL;氢火焰离子化检测器温度360℃,载气：氮气,尾吹流量（氮气）25 mL/min;乳粉中OPL的添加量为1～6 g/100 g时,加标回收率为95.2%～101.9%,相对标准偏差为1.289%～1.998%;方法的检出限为0.2 g/100 g,定量限为1.0 g/100 g。该方法操作简单、结果准确、重复性好,适用于乳粉中OPL的测定。     

GST-甘油-3-磷酸脱氢酶的分离及纯化

为了解重组酿酒酵母GCY1基因表达甘油-3-磷酸脱氢酶的情况,试验采用SD-URA 2%半乳糖、3×YP+6%葡萄糖、SC-URA 2%半乳糖、SC-URA 2%半乳糖+5%Na Cl 4种培养基诱导培养粉碎破壁酵母,采用蛋白质全自动高速纯化,并用SDS-PAGE凝胶电泳测定分子量。结果表明:含有GCY1基因的酿酒酵母在25℃下振动培养48 h其3×YP+6%葡萄糖培养物的OD600值为8.75,SC-URA 2%半乳糖+5%Na Cl培养物的OD600值为7.35。采用Profinia低压液相色谱纯化,只有SC-URA 2%半乳糖+5%Na Cl培养基中酿酒酵母表达了甘油-3-磷酸脱氢酶,且经SDS-PAGE凝胶电泳测得分子质量为65 ku。     

表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶的基因工程酵母菌株

本专利利用基因工程手段，通过毕赤酵母生产葡聚糖酶。将重组酵母进行诱导发酵，对重组酶进行初步酶学性质分析表明，最适反应pH约为5．5，最适反应温度约为55℃。从芽孢杆菌菌株Bacillus licheniformis EGW039中克隆出β-（1，3）-（1，4）葡聚糖酶基因，将不带有DNA原基因信号肽编码序列的β-（1，3）-（1，4）葡聚糖酶基因插入到毕赤酵母表达载体pMETaA上.     

布鲁氏菌侵染过程中has-miR-5196-3p对炎症小体的调控作用

试验旨在研究miRNA分子has-miR-5196-3p在布鲁氏菌侵染THP1细胞过程中对NOD样受体蛋白3炎症小体（NLRP3）的调控作用。运用TargetScan、MiRDB等生物信息学预测网站预测has-miR-5196-3p和NLRP3-3'UTR的结合位点,构建其野生型及突变型双荧光素酶报告载体,分别与has-miR-5196-3p mimics及阴性对照共转染293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组相对荧光素酶活性的变化,验证has-miR-5196-3p和NLRP3-3'UTR的靶向关系;布鲁氏菌侵染THP1细胞,实时荧光定量PCR检测NLRP3、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase1）及has-miR-5196-3p mRNA的表达情况,Western blotting检测NLRP3和caspase1蛋白表达水平;将has-miR-5196-3p mimics、has-miR-5196-3p inhibitor及阴性对照转染至THP1细胞,实时荧光定量PCR及Western blotting检测NLRP3和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase1）的表达水平。结果显示,试验成功构建含有NLRP3-3'UTR的野生型及突变型双荧光素酶报告载体;has-miR-5196-3p mimics极显著降低pmirGLO-NLRP3-3'UTR-wt的相对荧光素酶活性（P<0.01）;布鲁氏菌侵染THP1细胞后,NLRP3炎症小体被激活,而has-miR-5196-3p无明显变化（P>0.05）;has-miR-5196-3p mimics能显著抑制NLRP3的表达（P<0.05）,而has-miR-5196-3p inhibitor则相反。结果表明,miRNA分子has-miR-5196-3p可与NLRP3-3'UTR结合并抑制其表达,布鲁氏菌侵染THP1细胞过程中通过has-miR-5196-3p靶向负调节NLRP3炎症小体的表达及炎症的发生。     

色氨酸细菌代谢产物吲哚-3-丙酸降低大鼠的增重

近来研究表明色氨酸作为一种必需氨基酸,其在肠道经细菌代谢后的产物可发挥生物学作用。我们想要评估色氨酸代谢产物对增重的影响。研究由三个试验组成,分别对雄性斯普拉格-道利大鼠进行分组处理下;(i)新霉素水溶液和饮用水处理组(对照组-1);(ii)高色氨酸组(TH),无色氨酸组(TF)和基础日粮组(对照组-2);(iii)色氨酸细菌代谢产物吲哚-3-丙酸组(I3P)和载体处理组(对照组-3)。结果发现,(i)新霉素处理组与对照组-1相比体重上升,但粪便以及血液中I3P的含量下降;(ii)TH组与对照组-2相比增重下降,粪便与血液中I3P的含量升高。相比之下TF组体重下降,血清总蛋白下降,尿量增加(iii)I3P处理组增重低于对照组-3。研究表明、色氨酸在肠道细菌代谢产物I3P有助于改变抗生素和富含色氨酸饮食导致的体重增加。     

日粮ω-6/ω-3 PUFA比例对生长期扬州鹅肉品质的影响

本试验旨在研究多不饱和脂肪酸比例对扬州鹅生长阶段肉品质的影响。在饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸1∶1∶1的前提下,通过调节日粮中不同的ω-6/ω-3多不饱和脂肪酸比例,设置3∶1、6∶1、9∶1、12∶1四组进行扬州鹅饲养试验。结果表明:(1)ω-6/ω-3比例对雏鹅的不同生长阶段腿肌的嫩度、42日龄滴水损失均无显著差异性影响(P0.05);(2)56日龄时12∶1组腿肌pH值显著高于比例为3∶1(P0.05),12∶1的胸肌pH值显著高于3∶1组(P0.05),而在此日龄内其他比例间及其他日龄不同比例间均无显著差异性(P0.05);(3)在42日龄时12∶1组肌肉失水率显著高于9∶1和3∶1,在70日龄时12∶1显著高于3∶1(P0.05)。结论:ω-6/ω-3PUFA比例对不同生长阶段扬州鹅肌肉品质有一定的影响,以12∶1组各阶段肌肉pH值和失水率较高,但对肌肉嫩度的影响不大。