云南花生丛枝植原体16S rRNA和核糖体蛋白基因序列分析

 利用植原体16S rRNA基因及核糖体蛋白基因(ribosomal protein, rp)通用引物对发生在云南元谋的花生丛枝病病株DNA进行PCR扩增,并对扩增片段进行序列测定。扩增获得的云南元谋花生丛枝植原体(PnWB-YNym)16S rDNA、16S-23S rDNA和23S DNA片段总长1 806 bp,rp基因扩增片段长1 171 bp。云南株系与来源于台湾和海南的花生丛枝植原体均有较高同源性。比较16S rDNA片段,发现云南株系在5个位点上与来自台湾或海南的株系存在碱基差异,其中有1个位点的差异是云南元谋株系特异的;再分别比较核糖体蛋白rplV-rpsC 2个基因所编码的氨基酸序列,发现云南株系rpsC编码的第194位氨基酸与台湾和海南的株系存在差异。经16S rDNA片段系统进化及iPhyClassifier在线分析,表明PnWB-YNym在分类上属于16SrII-A亚组成员,与候选种‘Candidatus Phytoplasma australasiae’相关;基于rp基因构建的系统进化树表明,PnWB-YNym与16SrII-A亚组各成员聚为同一亚进化支(iii)。     

福寿螺18S rRNA和28S rRNA基因片段的克隆与进化分析

为从分子水平上明确入侵我国的福寿螺在分类学上的地位,采用分子克隆和序列比对的方法,对来自菲律宾及我国广东、广西、浙江等不同地理种群福寿螺的18S rRNA基因和28S rRNA基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并同瓶螺科、田螺科和环口螺科相关物种进行系统发育分析。结果表明,获得的福寿螺18S rRNA基因和28S rRNA基因片段长度分别为602 bp、325 bp,且不同地理种群间碱基序列无差异。通过邻接法（NJ）和最大简约法（MP）构建的系统树基本一致,证实福寿螺隶属于瓶螺科,与田螺科物种亲缘关系较近,而与环口螺科亲缘关系较远。     

云南芝麻丛枝和花变叶植原体16S rRNA和rp基因序列分析

 本研究通过对表现出丛枝和花变叶症状的芝麻感病植株总DNA进行植原体16S rRNA和rp基因的PCR扩增、克隆、测序及序列分析,明确了两种病株的病原均为植原体,并将其命名为云南元谋芝麻丛枝植原体(SEWB-YNym)和云南元谋芝麻花变叶植原体(SEP-YNym)。两个株系的16S rRNA基因片段长度均为1 248 bp,并且碱基序列完全一致。通过与其他地区报道的芝麻植原体株系16S rRNA基因序列比对后发现这两个株系与来自缅甸的株系不存在位点差异,而与泰国、中国台湾、印度的株系分别存在3~6个位点差异。同时,还从两个株系中获得了长度均为1 171 bp并且碱基序列也完全一致的SEWB-YNym和SEP-YNym的rp基因序列。此rp基因序列包括全部rpl22基因(nt90-476)和部分rps3基因(nt550-1170),分别编码128和206个氨基酸。通过对16S rRNA和rp基因的序列进行同源性比对、构建系统进化树等分析,表明两个株系与候选种‘Candidatus Phytoplasma aurantifolia'相关,为16SrII-A亚组成员,并归属于植原体rp-iii亚进化支。     

湖南猕猴桃溃疡病菌16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区序列的克隆与分析

为明确湖南省猕猴桃溃疡病其致病菌的种类与特征,以猕猴桃主栽品种红阳、米良1号的溃疡病感病枝条为材料,采用BPA培养基、平板划线和梯度稀释法分离病原菌。利用引物27F/1492R和Psa F1/Psa R2对湖南省猕猴桃溃疡病菌16S r DNA和16S-23S r DNA间隔区序列(ITS)进行PCR扩增并进行核苷酸序列测定及相似性分析。获得Psa-JSHY株系、Psa-LXHY株系以及Psa-LXML株系的16S r DNA基因片段1 383 bp及16S-23S r DNA间隔区序列280 bp,且序列一致。经序列相似性比较表明:所分离株系的16S r DNA与法国181、新西兰ABAC9、意大利IKB4等株系的16S r DNA基因序列一致,与日本的KW11等株系存在3个碱基的差异,相似性为99.78%,与国内分离的11-830-1株系存在4个碱基的差异,相似性为99.71%;16S-23S r DNA-ITS序列与中国SXHY11-1、西班牙EFA131.1、葡萄牙PA838、韩国KBE9等株系的ITS序列一致。构建16S r DNA及16S-23S r DNA-ITS序列的进化树,可以看出所分离的株系与已报道的P.syringae pv.actinidiae各菌株聚在同一个进化枝上。以上结果表明,湖南地区分离的3个猕猴桃溃疡病菌致病株系均属于P.syringae pv.actinidiae。     

鉴定植物细菌的核酸探针:属专一性16s rRNA序列的鉴定

发展鉴定植物细菌的 DNA 探针需要有效的程序,以鉴定靶细胞内存在的高拷贝数的靶专一性核酸序列.本文测定了52株细菌菌株的16s rRNA 序列.在鉴定属专一性序列区段的基础上,评价了以16s rRNA 序列为一种模板,来制备植物细菌专一性 DNA 探针的适用性.     

16S nested-PCR技术检测玉米细菌性枯萎病菌

 玉米细菌性枯萎病是玉米上的重要种传病害,病原菌为Pantoea stewartii subsp.stewartii。本研究设计了16S通用引物,扩增该病菌及其近似种的16S rDNA,通过序列测定和分析,针对该病菌设计了特异性引物,采用nested-PCR技术,能够准确地区别该病菌及其近似种,检测的灵敏度在DNA水平上达到10^-3 pg级,检测活菌则达到2 cfu。检测人工污染的玉米种子时,不受种子提取液中其它物质的干扰,灵敏度依然达到2 cfu。     

采用16S rDNA鉴定甜瓜细菌性叶斑病菌

从甘肃河西、新疆阿勒泰甜瓜上分离获得的2株致病细菌,通过16S rDNA序列测定以及序列同源性比较,结合病原菌落培养性状、菌体形态观察和革兰氏染色反应等,初步确定当地甜瓜细菌性叶斑病菌为丁香假单胞杆菌[Pseudomonas syringae pv.lachrymans (Smith et Bryan) Young et al.]     

青海省不同生态区蚕豆根瘤菌16S rDNA分析

为了阐明青海省蚕豆根瘤菌的遗传多样性和亲缘关系,同时为发现和获得新的根瘤菌物种提供资源,采集和分离了青海省不同生态区蚕豆主栽品种青蚕14中的根瘤菌,并对其中分离到的6个菌株(CD1~6)进行16S rDNA鉴定分析。将6株蚕豆根瘤菌的全序列结果与NCBI中已报道的序列进行相似性比对,发现其相似度较高,其中供试菌株CD4与KF008225.1相似度最高,达到98%,其余均在95%到96%之间。6株供试菌分属4个菌属,CD1和CD2共属节细菌属,CD3属于分枝杆菌属,CD4和CD5属于快生根瘤菌属,CD6属于中慢生根瘤菌属,表明来自不同地区的蚕豆根瘤菌存在较大差异。聚类分析结果显示,蚕豆根瘤菌的6个菌株分属5个不同系统发育分支,证明青海省不同生态区蚕豆根瘤菌种类多样性较为丰富。     

采用16S rDNA鉴定甜瓜细菌性叶斑病菌

从甘肃河西、新疆阿勒泰甜瓜上分离获得的2株致病细菌,通过16S rDNA序列测定以及序列同源性比较,结合病原菌落培养性状、菌体形态观察和革兰氏染色反应等,初步确定当地甜瓜细菌性叶斑病菌为丁香假单胞杆菌[Pseudomonas syringae pv.lachrymans (Smith et Bryan) Younget al.]     

以18S rRNA为内参照的多重RT-PCR检测3种百合病毒

 本研究对多重PCR体系各成分和循环参数进行了摸索和优化,建立了以18SrRNA为内参照的同时检测3种百合病毒的多重RT-PCR体系,所检测的3种病毒是黄瓜花叶病毒(CMV)、百合斑驳病毒(LMoV)和百合无症病毒(LSV)。它们为侵染我国百合的主要病毒。在RT反应体系中加入3种病毒和18S rRNA的特异性反向引物的混合物,使反应体系中各反向引物终浓度均为0.5μmol/L,反转录酶(AMV)反转录合成各病毒和18SrRNA的互补第一链cDNAs。多重RT-PCR条件实验显示:将标准RT-PCR体系中的Taq HS DNA聚合酶量改为0.100U/μL,Mg²⁺浓度改为4.0mmol/L,各引物浓度选择0.2μmol/L,那么25个循环反应以上就能在一个反应管中以18SrRNA为内参照同时检测百合中的3种常见病毒。用该体系检测了10个百合样品,同时与³²P同位素标记膜杂交检测作对照,结果显示,该检测体系检测灵敏度更高。     

植原体16S rDNA RFLP指纹图谱分析软件研究

 植原体是一类寄生于植物韧皮部的原核生物。目前国际上主要根据植原体16S rDNA RFLP图谱的比对进行分类及鉴定。传统的PCR-RFLP试验步骤繁琐、重复性差,误差大,尤其在检测鉴定大量植原体病原时,耗时、耗力。通过对目前已公布的全部植原体16S rDNA序列进行比对整理,并生成16S rDNA RFLP电子指纹图谱库。在此基础上开发了指纹图谱分析软件DNA-FP Cluster1.0。该软件可基于序列或图谱形式进行比对,并自动输出比对结果。结果呈现形式为3种:即一种16S rDNA RFLP图谱与多种图谱间相似性分析;多种16S rDNA RFLP图谱间相似性分析;16S rDNA RFLP图谱间相似度树状图。该软件在不需要酶切试验操作的情况下实现了对植原体的快速分类与鉴定,并解决了因植原体材料不全而无法进行植原体酶切后比对的难题,为今后植原体候选种内的细化分类提供了方法与工具。     

天津滨海新区泡桐丛枝病植原体16S rDNA基因序列分析

利用分子生物学技术对天津滨海新区泡桐丛枝病病原进行分类鉴定。采用植原体16S rDNA通用引物R16mF2/R16mR1对患病植株总DNA进行PCR扩增,得到约1.4 kb特异性片段。克隆测序、Blast比对和iPhyClassifier分析结果表明,天津滨海新区泡桐丛枝植原体16S rDNA基因片段长1 432 bp,与国内泡桐丛枝植原体PY株系相似性最高,达99.86%,归属于16SrI组(aster yellows group,翠菊黄化组)D亚组。系统树构建与分析显示,泡桐丛枝病天津滨海株PaWB-TJBH与16SrI其他亚组亲缘关系较近,同在16SrI组进化枝上,与16Sr I-D组亲缘关系最近;16S rDNA序列RFLP电子酶切图谱表明,PaWB-TJBH属于16SrI-D组一个成员,与同源性比较和系统进化分析结果一致。     

小麦蓝矮病植原体16S rDNA序列分析研究

 小麦蓝矮病是我国西北地区冬小麦上一种重要病害。本研究利用植原体16S rDNA通用引物对小麦蓝矮病患病植株全DNA进行nest-PCR扩增,获得1.2 kb的特异片段,并对扩增产物进行核苷酸序列测定,从分子水平证明了小麦蓝矮病的病原是植原体。利用最大简约法构建了16S rDNA系统演化树,系统演化关系分析表明:小麦蓝矮病植原体应该归属于翠菊植原体(Candidatus Phytoplasma asteris);小麦蓝矮病植原体与三叶草变叶病植原体(CPh)关系密切,被聚类为同一亚组(16Sr I-C),但是它们在寄主范围和传播介体等生物学性状方面差异很大。     

赛葵花变叶植原体的鉴定及其16S rDNA序列特征分析

在海南的赛葵上发现了类似植原体感染的病症,症状表现为花变叶和叶片变小。本研究通过植原体16S r DNA通用引物P1/P7对表现症状的赛葵植株进行了PCR检测,并对检测到的植原体病原16S r DNA进行了克隆测序、序列比对、虚拟RFLP分析和系统进化树构建分析。结果表明,该植原体为翠菊黄化植原体候选种相关株系,属于翠菊黄化植原体组(16SrI)的B亚组(相似系数为1.00)。     

16S rDNA克隆文库方法分析中华通草蛉共生细菌组成

中华通草蛉chrysoperla sinica(Tjeder)是农田生态系统中重要的捕食性天敌,为探索内生菌与宿主取食和生殖生理关系,本研究采用16S r DNA克隆文库的方法探究了中华通草蛉成虫内生菌的组成,分析了雌、雄成虫体内内生菌菌群结构是否存在差异。研究结果表明,中华通草蛉内生菌主要分3大类群:γ变形菌γ-Proteobacteria、α变形菌α-Proteobacteria和β变形菌β-Proteobacteria。按照属划分,中华通草蛉成虫共生细菌主要包含沃尔巴克氏体Wolbachia sp.、立克次氏体Rickettsia sp.、肠杆菌属Enterobacter sp.、免培养细菌Methyloversatilis sp.、沙雷氏菌Serratieae sp.、泛生菌属Pantoea sp.和欧文氏菌Erwinia sp.。仅在雌虫中存在Cosenzaea sp.,雄虫中存在醋酸杆菌属Acetobacter sp.、Asaia sp.、Rosenbergiella sp.、柠檬酸杆菌属Citrobacter sp.。得到中华通草蛉内生菌的优势菌群为沃尔巴克氏体Wolbachia pipientis,在雌、雄成虫中分别占23.2%和18.4%。结果证明中华通草蛉存在多种内生菌,雌、雄群体间存在差异。     

仙人掌丛枝病植原体检测和16S rDNA片段序列分析

 对仙人掌丛生幼嫩组织进行超薄切片电镜观察,在韧皮部筛管中存在大量植原体;根据植原体16S rRNA基因保守序列设计的通用引物对R16 F₂/R₂,应用PCR技术对仙人掌丛枝病进行分子检测,结果扩增到约1.2 kb的特异性片段,而在健康组织中却没有此特异片段;通过16S rDNA片段核酸序列同源性比较,结果表明仙人掌丛枝病植原体与花生丛枝病植原体亲缘关系最近,据此可初步判断仙人掌丛枝病植原体是一种属于16Sr Ⅱ组的植原体,基本确定了其分类地位。     

海南长春花黄化病植原体的16S rDNA序列分析研究

 Periwinkle(Catharanthus roseus) yellows is a common disease in Hainan. Periwinkle's leaf tissue with symptoms was assayed for phytoplasma infection by using PCR assay employing phytoplasma universal 16S rRNA gene primers (Rl6mF2/Rl6mR1). A PCR product (about 1.4 kb) was amplified from periwinkle showed yellows. Nucleotide sequencing and phylogenetic tree analysis showed that the amplified 16S rDNA contained 1 432 nucleotides, the most homology was 98.1% with the members of elm yellows group (16S r Ⅴ) and clustered in the same clade, while it was under 96.1% with other phytoplasma groups. Our results suggested that the phytoplasma sample belonged to 16S rⅤgroup and was tentatively named as Hainan periwinkle yellows phytoplasma (PY-Hn). This is the first report of existence of 16S r Ⅴ group phytoplasma in naturally infected periwinkle.     

基于16S rDNA序列的小贯小绿叶蝉共生细菌多样性研究

利用Illumina HiSeq技术,对赤壁、大悟、武汉、咸安和英山5个茶园小贯小绿叶蝉地理种群的成虫共生细菌16SrDNA-V4变异区进行测序,应用Uparse和RDP Classifier等软件统计和分析样本的物种组成、丰度和多样性。5个地区小贯小绿叶蝉成虫的16SrDNA基因序列文库共获得239 645条有效tags,在97%相似阈值下将其聚类为3 403个OTUs。共注释到41个门,116个纲,197个目,272个科,372个属,105个种。5个样本的共生菌在不同分类水平上的组成有所不同,其中在门水平上,主要优势菌为变形菌门Proteobacteria(相对丰度60.6%~97.1%);在纲水平上,相对丰度排名前5位中共有的优势菌为γ-变形菌纲Gammaproteobacteria和α-变形菌纲Alphaproteobacteria;在属水平上,排名前10位中5个样本共有的优势菌为盐单胞菌属Halomonas、希瓦氏菌属Shewanella和沃尔巴克氏体属Wolbachia。小贯小绿叶蝉成虫细菌的Chao指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数分别为1 065.55~2 841.89,1 130.76~2 914.90,1.07~8.63和0.18~0.99。茶园小贯小绿叶蝉成虫共生细菌多样性比较丰富,不同地理种群的小贯小绿叶蝉细菌群落结构和多样性有差异。本研究结果为进一步研究细菌对小贯小绿叶蝉种群生物学的影响奠定了基础。     

小麦蓝矮病植原体16S rDNA基因片段的比较分析

 小麦蓝矮病是陕西乃至西北冬麦麦区的一个重要病害,由介体条沙叶蝉专化性传播。对小麦蓝矮病株叶片和带毒条沙叶蝉进行超薄切片及电镜观察,在叶片韧皮部和叶蝉后肠中均观察到大量典型植原体。利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物对Rm16F2/Rm16R1,应用PCR技术从小麦蓝矮病株叶片中扩增到1.4 kb的特异片段。通过对16S rDNA基因片段序列同源性比较,结果表明小麦蓝矮病病原与三叶草绿变、翠菊黄化、绣球花绿变、草莓矮化和番茄巨芽植原体亲缘关系较近,其同源率为99.2%~99.9%。据此可以判定小麦蓝矮病植原体是属于植原体16SrⅠ组,确定了其分类地位。