常规PCR与巢式PCR法快速检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)

对传统对虾白斑综合征病毒(WSSV)的PCR检测方法中的病毒模板DNA的提取方法加以改进,建立了一种快速检测克氏原螯虾(Procambarus clarkii)WSSV的PCR方法。本方法将克氏原螯虾肝胰腺组织匀浆液冻融3次进行差速离心后,在病毒沉淀中加入50μL蛋白酶K溶液,室温消化5 min,沸水中煮10 min后,10000 r/min高速离心5 min即可取上清液用于PCR扩增,结果显示:与传统的病毒模板DNA提取方法相比,本方法的PCR结果特异性强,扩增效率高,准确率高,可应用于快速大规模检测克氏原鳌虾中的WSSV。     

克氏原螯虾掘洞行为研究

克氏原螯虾(Procam barus clarkii)掘洞时间多在夜间,可持续掘洞6~8 h,一夜挖掘深度成虾可达40 cm,幼虾可达25 cm。成虾的洞穴深度大部分在50~80 cm之间,少部分可以达到80~150 cm;幼虾洞穴的深度在10~25 cm之间;体长1.2 cm的稚虾已经具备掘洞的能力,洞穴深度在10~20 cm之间。洞穴分为简单洞穴和复杂洞穴两种:85%的洞穴是简单的,即只有一条穴道,位于水面上、下10 cm之间;15%较复杂,即有2条以上的穴道,位于水面以上20 cm处。洞穴的密度为2.8~5.6个/m2。每个洞穴中一般有1~2只虾,但冬季也常发现一个洞中有3~5只虾。克氏原螯虾在繁殖季节掘洞强度增大,在寒冷的冬季,掘洞强度微弱。     

湖北省潜江地区克氏原螯虾(procambarus clarkii)白斑综合征(White Spot Syndrome)PCR诊断及组织病理学观察

近年来在湖北省范围内人工养殖的克氏原螯虾暴发了严重的疾病,其中白斑综合征病毒（WSSV）已成为危害克氏原螯虾健康养殖的重要病原。2016年5月湖北省潜江市养殖区暴发了一种传染性疾病,为探究此次疾病病因和流行规律,将染病虾进行临床症状观察、对病料进行PCR检测、系统发育树分析、人工感染和组织病理学观察。结果显示,发病克氏原螯虾临床症状主要表现为摄食减少,活力下降,反应迟钝;组织病理学观察结果显示,克氏原螯虾的肝胰腺、肠、肌肉、鳃组织均出现不同程度变性和坏死以及炎性细胞浸润等典型病理学变化,与WSSV感染克氏原螯虾出现的病变相似;PCR检测患病克氏原螯虾样品,结果显示WSSV呈阳性,阳性检出率为55.56%（15/27）,未检测到斑节对虾杆状病毒（MBV）和传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）;检测产物测序并进行系统发育树分析,结果显示,该基因序列与WSSV的EG3株（KR083866.1）核苷酸序列同源性为100%。将病虾的肝胰腺、肠和肌肉组织投喂健康克氏原螯虾,投喂组均表现为急性死亡（累积死亡率为100%）,并出现与自然发病虾相同的症状。WSSV的巢式PCR检测结果显示,人工感染病虾为WSSV阳性。根据以上显示,本次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原是WSSV。     

注射白斑综合征病毒对克氏原螯虾酚氧化酶活力的影响

将白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)、大肠杆菌(Escherichia coli)(DH5α)用注射法接种克氏原螯虾(Procambarus clarkii),在0~72 h之间定时检测克氏原螯虾血细胞和肝胰脏中酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)活力变化。结果显示:(1)0.1 mg/m L和1 mg/m L胰蛋白酶处理样品后,样品间差异不显著。(2)加胰蛋白酶处理与未加胰蛋白酶相比,供试克氏原螯虾PO活力均升高。(3)未加胰蛋白酶与加胰蛋白酶表现出相似的特征,WSSV和Ah注射组与对照组相比均表现为,12~48 h PO活力显著高于对照组,并且在48 h达到最大值,72 h时基本恢复正常;注射DH5α组与对照组相比没有显著性变化。可见感染WSSV后,克氏原螯虾体内酚氧化酶活力发生了变化,由此推测,PO参与了螯虾体内抵御病毒的免疫反应。     

克氏原螯虾繁殖生物学研究

对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)繁殖生物学进行了研究。结果显示:克氏原螯虾的性成熟年龄为1年左右;雌虾最小体长为6.4 cm,最小体重为10 g;雄虾最小体长为7.1 cm,最小体重为20 g。5~9月为交配期,其中以6~8月为交配高峰期。克氏原螯虾交配后大约为30 d左右产卵。繁殖期为7~10月,高峰期为8~9月。10月底以后抱卵的虾由于水温逐步降低,一直延续到第2年春季才孵化。克氏原螯虾的繁殖行为与掘洞行为密切相关,繁殖期的掘洞数量较非繁殖期明显增多。7~10月,亲虾均栖息在洞内繁殖,洞穴深度为50~80 cm。卵巢为一次产卵类型。雌雄比例为1∶1。克氏原螯虾的个体绝对繁殖力的变动范围为172~1158粒,平均为517粒。个体相对繁殖力(F/W)的变动范围为2~41粒/g,平均为21粒。个体相对繁殖力(F/L)的变动范围为47~80粒/cm,平均为63粒。     

安徽省克氏原螯虾白斑综合征病毒检测及疾病分析

2018年4—5月在安徽省4个市采集稻田养殖的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)样本480份,采集池塘、水库的野生克氏原螯虾样本180份,进行白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)套式PCR检测,并对稻田的水环境、虾的养殖密度、产量及疾病发生情况进行跟踪调查。结果显示,野生虾、养殖虾的WSSV携带率分别为8.89%、98.13%。虾中WSSV首轮PCR检测阳性率≥50%的稻田有10个,其中5个稻田中高密度养殖虾的病死率达20%及以上,5个稻田中适宜密度养殖虾的病死率为10%及以下。pH值偏高、溶解氧过饱和的5号稻田和溶解氧过饱和的6号稻田中高密度养殖虾的病死率也分别高至50%、60%。     

养殖克氏原螯虾体内白斑综合征病毒的绝对定量分析

近年来克氏原螯虾的养殖受到WSSV的威胁,病毒在宿主组织中的绝对定量对于了解病毒的致病性具有重要意义,但克氏原螯虾组织中WSSV的绝对定量分布还有待研究。实验调查了湖北省5个主养区克氏原螯虾WSSV的感染率,结果表明80%以上克氏原螯虾都携带有WSSV。采用WSSV-VP28蛋白特异性抗体对克氏原螯虾提取蛋白进行Western Blot检测,在WSSV-PCR阳性样品中可检测到VP28特异性条带,在WSSV-PCR阴性样品中没有检测到相应条带。采用实验室建立的WSSV绝对定量PCR方法,对携带病毒的克氏原螯虾6个组织(鳃、胃、肠、血淋巴细胞、肝胰腺和心脏)进行检测。结果表明,在鳃、胃和肠可检测到较多病毒量(约108拷贝/mg),其次是血淋巴细胞(107拷贝/mg)、肝胰腺(106拷贝/mg),在心脏中病毒的含量最低(103拷贝/mg),表明病毒的复制存在组织特异性。结果显示WSSV主要存在于消化系统中,预示着克氏原螯虾可能主要在摄食过程中感染WSSV;不同地区克氏原螯虾组织病毒携带量表现出一定差异,预示着WSSV感染可能受到环境因素的影响。     

克氏原螯虾捕捞网目研究

由于克氏原螯虾(Procambarus clarkii)生存能力强,天敌少,加之其有一定的经济价值,为了更好地捕捞克氏原螯虾种群且尽量少伤害水域中其他渔获种类,有效控制克氏原螯虾种群数量,防止形成外来物种入侵,通过基本情况调查和室内试验等方法对克氏原螯虾捕捞网目进行研究。对6,20,30,40,50,60,70 mm七种网目的地笼网进行了室内试验,经比较对克氏原螯虾的捕捞能力和鱼类释放效果,结合线性拟合曲线与克氏原螯虾体长的关系,推算出20 mm网目为春季克氏原螯虾最佳捕捞网目, 30 mm网目为秋季克氏原螯虾捕捞最佳捕捞网目。     

春季克氏原螯虾捕捞网具研究

根据克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的生物学习性,设计了15、20、25、30、35 mm五种网目的无帽、带帽、半圆、对口四种网型的地笼网,开展了春季克氏原螯虾室外捕捞试验,探索出春季最适克氏原螯虾捕捞网具。结果表明:20 mm网目无帽型地笼网对春季克氏原螯虾的捕捞能力最好,最适宜推广。     

克氏原螯虾酚氧化酶部分生化特性的研究

以克氏原螯虾(Procambarus clarkii)酚氧化酶(PO)为材料,采用L-DOPA为反应底物,分光光度计测定不同温度和pH条件下PO活力,研究克氏原螯虾PO的特性,为其免疫学研究及优化PO准确测定方法提供依据。结果显示PO活力最高时的温度为35℃,低于和高于35℃活力逐渐下降,45℃以上活力迅速下降;0℃仍具有最高活力的24%。在pH4.0～9.5内PO均具有活力,鳃组织最佳pH5.5,血清最佳pH6.5。因此测定克氏原螯虾PO活力的最佳参数为温度35℃,pH5.5(鳃)或6.5(血清)。以上结果说明冰浴终止反应法测定克氏原螯虾PO活力会影响结果的准确性,要慎用。     

Response of crayfish, Procambarus clarkii, haemocytes infected by white spot syndrome virus

White spot syndrome virus (WSSV) is a serious pathogen of aquatic crustaceans. Little is known about its transmission in vivo and the immune reaction of its hosts. In this study, the circulating haemocytes of crayfish, Procambarus clarkii, infected by WSSV, and primary haemocyte cultures inoculated with WSSV, were collected and observed by transmission electron microscopy and light microscopy following in situ hybridization. In ultra-thin sections of infected haemocytes, the enveloped virions were seen to be phagocytosed in the cytoplasm and no viral particles were observed in the nuclei. In situ hybridization with WSSV-specific probes also demonstrated that there were no specific positive signals present in the haemocytes. Conversely, strong specific positive signals showed that WSSV replicated in the nuclei of gill cells. As a control, the lymphoid organ of shrimp, Penaeus monodon, infected by WSSV was examined by in situ hybridization which showed that WSSV did not replicate within the tubules of the lymphoid organ. In contrast to previous studies, it is concluded that neither shrimp nor crayfish haemocytes support WSSV replication.     

Oral vaccination trials with crayfish, Procambarus clarkii, to induce resistance to the white spot syndrome virus

The potential of oral vaccination against white spot syndrome virus (WSSV) in crayfish Procambarus clarkii was investigated. The protective effect of binary ethylenimine (BEI)-inactivated WSSV was tested by oral vaccination, followed by an oral challenge with WSSV. The crayfish fed with feed pellets coated with BEI-inactivated WSSV showed a resistance to WSSV on the seventh day post vaccination (dpv). The relative percentage survival values were 60%, 70% and 75% for the vaccinated once, twice and thrice with inactivated WSSV. Following an intramuscular injection experiment, no mortality was recorded in the inactivated WSSV group and the negative control at 17 days post challenge. The cumulative mortalities in the heated WSSV group and WSSV group were 100%. Shrimp that survived the WSSV challenge on the seventh day after cessation of oral vaccination were positive for the presence of WSSV by a polymerase chain reaction assay specific for WSSV. This result indicated that inactivated WSSV could protect crayfish against WSSV by oral delivery.     

White Spot Syndrome Virus in cultured shrimp: A review

Shrimp is one of the main aquaculture species in the world. Different viruses affect them, which causes serious mortality to economically important species, such as Penaeus monodon, Litopenaeus vannamei and L. stylirostris, among others. White spot syndrome virus or WSSV is a highly lethal, stress‐dependent virus, which belongs to the family Nimaviridae, genus Whispovirus. Three WSSV virus isolates were first detected in 1992 in Thailand, Taiwan and China. Later, a fourth isolate of the virus was detected in the Americas in 1999. This virus has a large circular double‐stranded DNA genome with different sizes (292.9–307.2 kb), where the diverse isolates show differences in virulence. This virus infects a wide range of aquatic crustaceans by vertical and horizontal transmission, with different mortality results. The spread of infection between regions may be due to infected shrimp and carriers such as other crustaceans, seabirds, aquatic arthropods or other vectors. The aim of this work is to describe the current knowledge on the status, transmission, pathology, isolation, control and genomic characteristics of WSSV.     

硫酸锌慢性毒性胁迫下克氏原螯虾的组织病理

将克氏原螯虾(Procambarus clarkii)成虾在Zn2+质量浓度为0、0.40 mg/L、4.04 mg/L和40.37 mg/L的硫酸锌溶液中浸浴21 d,分别于第7、14和21天时每组随机抽取5只虾,采集肝胰腺、鳃、触角腺、性腺、肌肉及消化道组织,于Bouin′s液中固定24 h。采用石蜡切片和HE染色的方法,观察其组织的病理变化,从组织学水平研究硫酸锌对克氏原螯虾的慢性毒性作用。结果显示,浸浴时各Zn2+浓度组肝胰腺、触角腺细胞质中出现被染成红棕色的颗粒,且颗粒的数量与浸浴浓度及时间成正相关。0.40 mg/L组在浸浴期间各组织均未出现其他明显病变;4.04mg/L组及40.37mg/L组从浸浴第7天开始肝胰腺、触角腺、鳃组织出现出血、细胞坏死等病变,随浸浴浓度增大和时间延长坏死细胞比例增大。40.37 mg/L组第14天时精母细胞开始出现坏死;第21天时精巢、卵巢严重出血,精、卵细胞出现大面积坏死,肝细胞大量坏死脱落,肝小管结缔组织增生,大量脱落的细胞塞满管腔使肝胰腺表面形成肉眼可见的红棕色颗粒状斑点。结果表明在Zn2+质量浓度高于4.04 mg/L的硫酸锌浸浴21 d后,克氏原螯虾肝胰腺、触角腺、鳃、性腺组织均出现不同程度的病变,表明其代谢系统、呼吸系统、生殖系统等受到较严重的损伤,因此长期暴露在Zn2+质量浓度高于4.04 mg/L的环境中会严重威胁克氏原螯虾的生存和繁殖。     

克氏原螯虾自噬相关基因PcAtg2的克隆及其在白斑综合征病毒胁迫下的表达分析

为了解自噬相关基因Atg2在克氏原螯虾(Procambarus clarkia)先天免疫中的作用,本研究克隆了克氏原螯虾Atg2 (PcAtg2)基因全长序列。生物信息学分析显示,PcAtg2蛋白编码序列全长为9 966 bp,推测其编码2 189个氨基酸。组织定量表达分布显示,PcAtg2在克氏原螯虾的各个组织中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,在眼柄中表达最低。在白斑综合征病毒(WSSV)感染实验中,PcAtg2基因表达量在不同组织中均呈现显著上调趋势。RNA干扰(RNAi)实验显示,PcAtg2基因沉默后,WSSV在克氏原螯虾体内的增殖明显被抑制,同时,自噬相关基因的表达量上调。透射电镜分析结果显示,在WSSV感染后,PcAtg2基因沉默组中克氏原螯虾肝胰腺组织中的自噬小体多于对照组。本研究结果可为了解克氏原螯虾应对WSSV胁迫下的调控机制提供理论参考。     

克氏原螯虾繁殖行为生态学的实验研究

针对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)初次性成熟、生殖季节、交配体制、交配行为、掘洞行为、护幼抚育行为等独特的生殖对策和行为特性展开研究。在克氏原螯虾主要繁殖季节进行野外自然采集成虾样本进行交配产卵等实验观察统计, 每批次采集成虾样本为30尾以上, 体质量在15~40 g。结果表明: 1) 克氏原鳌虾生长快速且性成熟早, 当年个体经6~12个月即可达到性成熟。2) 该虾属秋冬季产卵类型, 但交配季节宽泛, 繁殖期长, 一年中大部分时间均有交配现象。7月份(1龄、2龄, 体质量22.4 g±2.56 g)交配率为20%, 产卵率为0; 8月份(1龄、2龄, 体质量26.7 g±2.98 g)交配率为45%, 产卵率为5%; 9月份(1龄、2龄, 体质量29.3 g±3.11 g)交配率达到60%以上, 产卵率为10%; 10月份(1龄、2龄, 体质量30.9 g±3.39 g)交配率为75%以上, 产卵率为35%, 表明在自然条件下克氏原螯虾交配季节主要集中在8-10月, 产卵高峰期主要集中在10-12月。3) 交配体制属于繁殖行为学中的乱交制, 雌雄性比较为松散, 存在普遍的重复交配现象。4) 具有明显的穴居性, 掘洞行为是克氏原螯虾一个显著突出的生态习性, 繁殖季节掘洞强度显著增强, 掘洞目的主要为雌虾产卵孵幼, 其他季节的掘洞目的则是为躲避不良的生态环境, 冬春季则几乎没有掘洞行为, 即不同季节克氏原螯虾的掘洞有着不同的生态功能。克氏原螯虾繁殖行为生态学的研究可为其开展人工繁殖和生产养殖提供理论依据。