小鼠卵母细胞化学去核及手工构建核移植胚胎

为优化脱羰秋水仙碱（DC）诱导去核程序,研究以DC去核卵母细胞为核受体的、无透明带体细胞核移植方法在小鼠体细胞核移植中的应用,试验比较了乙醇、SrCl2两种激活方法及脱羰秋水仙碱处理开始时间对小鼠MⅡ期卵母细胞去核效率的影响;将DC诱导去核成功的卵母细胞去除透明带,与胎儿成纤维细胞粘合、电融合和SrCl2激活后,体外培养重构胚。结果显示,7%乙醇激活后0 min起始DC处理可得到最高的诱导去核率（66.4%）;而在8 mmol/L SrCl2中激活15 min后用DC处理可得到最高的诱导去核率（64.3%）;目前重构胚可以体外发育到8-细胞。试验结果首次证明了SrCl2在小鼠卵母细胞DC诱导去核中的作用效果与乙醇相当,初步证明了将DC诱导去核技术与无透明带技术相结合手工克隆生产小鼠重构胚的可能性,它的成功将大大简化核移植程序。     

改进的表面张力辅助去核法对小鼠卵母细胞去核的研究

为了探讨改进的小鼠表面张力辅助去核法（STA）的可靠性，本试验用改进的表面张力辅助去核法与表面张力辅助去核法对小鼠卵母细胞进行去核操作，比较其去核操作效率。结果发现，改进的表面张力辅助去核法能显著减少去核操作时间，去核率与表面张力去核法无显著差异。改进的小鼠表面张力辅助去核法是一种适用于小鼠卵母细胞操作的快速、简单、实用的去核方法。     

体内、外卵母细胞对猪体细胞克隆胚胎发育潜力的影响

为探讨猪体内、外成熟卵母细胞对核移植重组胚胎发育能力的影响,试验通过激素促排获得体内成熟卵母细胞和收集废弃卵巢获取体外成熟的卵母细胞,分别构建核移植重组胚,比较其卵裂率、囊胚率及胚胎移植受孕情况。结果显示,PGC+PMSG+HCG组的平均排卵数（27.8枚/头）显著高于PGC+HCG （12.5枚/头）、PMSG+HCG （13.7枚/头）及自然发情组（11.5枚/头）（P<0.05）,体内收集到的卵母细胞,可用于构建核移植重组胚的可用卵率均达到90%以上,与其他处理组差异不显著（P>0.05）,说明通过激素处理可获得更多的可用卵母细胞,而且卵母细胞的质量没有显著差异;以体内和体外成熟卵母细胞作为核移植受体构建的克隆胚胎,二者的胚胎融合率（80.31%和79.29%）和卵裂率（90.40%和86.51%）差异均不显著（P>0.05）,但来自体内成熟卵母细胞克隆的胚胎发育至囊胚期的比例显著升高（P<0.05）;将体内、外成熟卵母细胞构建的核移植重组胚分别移植代孕母猪,头平均移植30或60枚时,体内成熟卵母构建的克隆胚胎移植出生仔猪10头,而体外培养卵母细胞构建的克隆胚胎均未着床受孕,表明通过激素促排获得的卵母细胞质量更好,能显著提高克隆胚胎的囊胚率,减少胚胎移植数量,提高代孕母猪的怀孕率。     

秋水仙碱化学去核对山羊卵丘细胞核移植胚胎体外发育的影响

研究旨在探讨秋水仙碱化学去核在山羊卵母细胞去核中的应用及其对卵丘细胞核移植胚胎体外发育的影响。结果表明:用秋水仙碱处理山羊体外成熟19h的卵母细胞,可使其核区形成胞质突起,以此为指示进行显微操作去核率可达100%,且用0.8μg/mL秋水仙碱处理30min的山羊卵母细胞突起率可达91.27%,显著高于对照组及0.4μg/mL处理组(P<0.05),与1.6μg/mL处理组的突起率差异不显著(P>0.05)。通过比较盲吸去核法与秋水仙碱化学去核法构建的山羊卵丘细胞核移植胚胎的体外发育能力发现,秋水仙碱化学去核法构建的重构胚体外发育能力较高,桑椹胚发育率显著高于盲吸去核法(P<0.05)。     

手工克隆生产猪胚胎关键技术的改进研究

手工克隆(handmade cloning,HMC)是在传统克隆技术的基础上发展出的一种体细胞核移植技术,作为纯手工操作技术,每一步骤的操作细节都影响着HMC的效率及重构胚胎发育能力.本试验针对HMC生产克隆猪胚胎的3个关键步骤:透明带消化、手工切割去核与无透明带重构胚的体外培养展开研究.结果显示,猪卵母细胞透明带以3...     

亮甲酚蓝对猪卵母细胞体外成熟及核移植胚胎发育能力的影响

试验旨在研究亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)染色对卵母细胞体外成熟及后期胚胎发育潜力的影响。本研究利用13、26、39 、52 μmol/L BCB对成熟培养前的卵丘－卵母细胞复合体(cumulus-oocyte-complexes,COCs)染色90 min,比较各组卵母细胞的着色率、成熟率及孤雌激活胚胎和核移植胚胎的发育情况。结果表明,随着BCB浓度的增加,COCs着色率依次增加(20.00%、46.39%、51.66%和59.03%),但猪卵母细胞体外成熟率逐渐降低(74.03%、72.16%、70.53%和48.61%);不同浓度BCB染色后所得BCB⁺组卵的成熟率均明显高于BCB^-组。试验结果发现,BCB浓度在26 μmol/L时,经染色的COCs既有较高的着色率,且不影响其体外成熟的效率。基于此,研究选取26 μmol/L BCB作为最佳浓度对猪卵母细胞进行染色筛选,然后进行体外培养、孤雌激活及核移植试验。结果显示,筛选的BCB⁺组卵母细胞的孤雌胚和核移植胚的卵裂率和囊胚率均显著高于BCB^-组(P<0.05),而与对照组间无显著差异(P>0.05)。胚胎移植试验挑选BCB⁺组中发育较好的1-2细胞期重组胚对5头代孕母猪进行了移植,其中2头怀孕,1头顺利产下了6头健康胎儿。综合以上试验结果表明,利用BCB染色可作为一种有效的方法筛选体外成熟质量较高的猪卵母细胞,同时提高胚胎体外生产效率。     

卵母细胞去核及卵丘细胞移核方法对猪体细胞核移植的影响

以猪体外成熟卵母细胞周围分离得到的卵丘细胞作为猪体细胞核移植的供核细胞,研究了卵母细胞不同去核方法(盲吸法、活性荧光染色去核法、盲吸法和活性荧光染色法联合去核法)的去核率差异,并比较了卵丘细胞透明带下注核和胞质内注核两种重建胚构建方法的胚胎裂解率、4 8细胞发育率和桑椹胚率的差异。结果表明:(1)以荧光染料染色法的去核率(87.18%)最高,与其他试验组相比差异显著(P<0.05);盲吸法去核所用时间最少(1.2 min/个),与其他试验组相比差异显著(P<0.05)。(2)透明带下注核比卵母细胞质内直接注核的卵裂率(40.11%/29.75%)和4 8细胞率(11.86%/6.81%)高,差异显著(P<0.05);桑椹胚率(1.75%/1.79%)无明显差异(P>0.05)。     

放线菌酮处理对猪孤雌激活及体细胞核移植胚胎发育的影响

为研究放线菌酮(CHX)在猪卵母细胞孤雌激活和体细胞核移植中的作用效果,并验证其对胚胎发育的促进作用,实验对比体外成熟的猪卵母细胞经电激活后结合6-二甲氨基嘌呤(6-D)、细胞松弛素B(CB)或CHX激活后的孤雌囊胚率,及3种激活药物对体细胞核移植重构胚的发育能力的影响;在孤雌激活前用CHX预处理卵母细胞5 min,研究其对孤雌激活后胚胎发育能力的影响。结果表明:在孤雌激活过程中,CHX在激活8 h条件下囊胚率为48.0%,而CB和6-D处理4 h即可达55.2%和63.3%。而在体细胞核移植重构胚的激活中,采用CHX进行激活囊胚率为19.6%,高于CB的10.5%和6-D的16.5%,各组间差异显著(P>0.05)。孤雌激活前,卵母细胞经CHX预处理15 min可以提高CB或CHX激活的孤雌囊胚率。结果说明,CHX在孤雌激活能力较差,但对胚胎发育具有一定保护和促进作用。     

单宁酸对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

研究旨在探讨单宁酸对猪卵母细胞体外成熟质量及其胚胎发育能力的影响。在猪卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外成熟培养液中添加不同浓度（0、1、10、100 μg/mL）单宁酸培养42 h后,检测COCs的扩散程度和卵丘细胞扩散指数,统计COCs的体外成熟率,检测成熟卵母细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）和生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）的水平,并统计孤雌激活及体外受精胚胎48和168 h的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数。结果显示,与对照组相比,10 μg/mL单宁酸组卵丘细胞扩散指数显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率差异不显著（P>0.05）,100 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组GSH和GDF9水平显著提高（P<0.05）,ROS水平显著降低（P<0.05）。孤雌胚胎和体外受精胚胎发育能力结果显示,与对照组相比,各单宁酸组卵裂率差异不显著（P>0.05）,10 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚率及体外受精胚胎囊胚率显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚细胞数及体外受精胚胎囊胚细胞数均显著低于其他各组（P<0.05）。以上结果表明,10 μg/mL单宁酸可通过提高卵丘细胞扩散能力及GSH和GDF9水平、降低卵母细胞内ROS水平,改善猪卵母细胞成熟质量,提高孤雌胚胎及体外受精胚胎的发育能力。     

甘草酸单铵盐对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

将收集的猪COCs置于添加不同浓度(0.0,0.3,0.6,1.2μmol/L)甘草酸单铵盐(monoammonium glycyrrhizinate, MAG)的卵母细胞体外成熟培养液中培养46 h,统计成熟率,通过免疫荧光染色检测成熟卵母细胞ROS表达水平;对成熟卵母细胞体外受精,于胚胎培养液内体外培养48,120 h,分别统计体外受精胚胎卵裂率、囊胚率,并用Hochest荧光染色检测囊胚总细胞数;结合成熟率及IVF胚胎发育囊胚率选定最佳添加浓度,在体外成熟培养液中添加最适浓度MAG,以0μmol/L MAG为对照组,体外培养46 h后,利用免疫荧光染色检测猪成熟卵母细胞的线粒体膜电位水平和细胞凋亡水平。结果显示,与对照组相比,不同浓度MAG处理组猪卵母细胞体外成熟率均有所提高,但差异均不显著(P>0.05);不同浓度MAG添加均可降低猪卵母细胞ROS水平,与对照组相比,0.3,0.6μmol/L组差异显著(P<0.05),1.2μmol/L组差异极显著(P<0.01)。0.3μmol/L添加组显著提高了猪体外受精囊胚率(P<0.05),但不同MAG添加组对...     

提高猪核移植效率的研究进展

哺乳动物体细胞核移植(克隆)经过多年的发展,获得了多种后代。猪的核移植研究意义重大,应用价值颇高,是当今生物技术的热点研究之一。尽管猪核移植已取得了很大进展,但移植效率依然很低。本文就目前已有的资料,综述了提高猪体细胞核移植效率的各项技术环节的研究进展。     

水牛体细胞核移植方法的研究

探讨电融合参数对水牛体细胞核移植效果的影响。体外成熟培养 22~24 h的水牛卵母细胞,在含有 5μg/mL细胞松弛素的操作液中进行去核,然后将经0 .1 mg/L Aphidicolin (APD)处理1 d, 再用0. 5% FBS培养2~9 d的水牛耳皮成纤维细胞或颗粒细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中,再经电融合形成重构胚。重构胚经 5μmol/L离子霉素激活处理5 min并在2 mmol/L的 6 DMAP中培养 3 h后,在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中(30μL)培养7~9 d,观察其卵裂和胚胎发育情况。当电融合的电场强度为1 500 V·μs/mm(电压100 V/mm×脉时15μs)时,电脉冲3次,颗粒细胞核移植的融合率为 74.18%,分裂率为 71.82%,囊胚发育率为 10%,融合率显著高于2次电脉冲(52.03%,P<0. 05),卵裂率显著高于4次电脉冲(53.95%,P<0. 05);当电脉冲次数为 3 次时,电场强度为2 000 V·μs/mm的分裂率(53.54%)显著低于1 500 V·μs/mm,2 500 V·μs/mm的融合率(62.0%)和分裂率(53.23%)均显著低于1 500 V·μs/mm(P<0 .05)。采用耳皮成纤维细胞作供核的融合率(59.75%)和分裂率(57.45%)均显著低于颗粒细胞。染色体组型分析显示,66.7%的核移植胚胎具有正常的供体细胞二倍体核型。将来自1头22岁的摩拉公牛耳皮成纤维细胞的2枚冻胚移植给受体母牛,妊娠到215 d时发生流     

水牛体细胞核移植的研究

系统探讨了水牛体细胞核移植的各种影响因素，并初步建立了水牛体细胞核移植的一整套程序。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞去核后，将经血清饥饿(0.5％FBs)培养2～9d、0．1mg／L Aphidicolin(APD)培养 0．5％FBs培养2～9d或一般培养法(10％FBS)培养的水牛耳皮成纤维细胞或颗粒细胞，直接注射到去核的卵母细胞质中，或注射到卵周隙中再经电融合(100V／mm，15μs，电脉冲3次)构建重构胚。重构胚经化学激活后(5pmol／L离子霉素5min，2mmol／L6-DMAP3h)培养7～8d，评定其胚胎发育能力。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0．1mg／L APD 0．5％FBs培养处理后的重组胚卵裂率，均极显著高于血清饥饿和一般培养处理的同种供体细胞(P＜0.01)，但囊胚发育率无显著差异(P＞0．05)。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0.1mg／L APD 0.5％FBS处理后进行核移植的分裂率和发育率均无显著差异(63．06％比58．70％，P＞0．05)。以水牛颗粒细胞为核供体时，电融舍法的重构胚分裂率显著高于胞质内注入法(P＜0.05)，囊胚发育率无显著差异(P＞0.05)。培养3代和6代的水牛颗粒细胞以及培养6代和10代的耳皮成纤维细胞，其具有正常二倍染色体的细胞比例均无显著差异(P＞0.05)；以这2种细胞不同培养代数作供体进行核移植时，各代之间核移胚的体外分裂率、囊胚发育率无显著差异P＞0.05)。这些结果表明：(1)水牛耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经培养传代所建立起来的细胞系相对比较稳定；(2)0.1mg／L APD预培养处理供体细胞能提高水牛体细胞核移植的效果，但血清饥饿培养则无作用；(3)水牛耳皮成纤维细胞和颗粒细胞均可作供核细胞，核移植后都能得到体细胞克隆的囊胚，但前者的效果略优于后者，且其核移植效果不受供核细胞培养代数的影响；(4)电融合核移植胚胎的发育率高于胞质内直接注入法，但两者的总体效率相似。     

猪卵丘细胞核移植研究

以卵丘细胞为供核体细胞,采用胞质内注射法进行猪体细胞核移植,对去核、激活和培养等关键技术过程进行研究,结果表明,①点压法、挤压法对卵母细胞去核率明显高于盲吸法(三者分别为62.5%,64.6%,50.7%,P<0.05)。盲吸法去核染色体容易发生位置偏离,影响去核效果,但对早成熟的卵母细胞(36h～44h)进行去核可明显提高去核效率(P<0.05),在成熟培养36h～38h、39h～41h、42h～44h去核率分别为60.9%、67.8%、64.3%,而45h～48h为48.4%。②体细胞预激活有助于提高核移胚卵裂率(28.0%,20.1%,P<0.05)。A23187(Ca2 ionophore,钙离子载体)单独或与6DMAP(6Dimethylaminopurine,6二甲基氨基嘌呤)联合作用能使猪体细胞核移胚激活继续发育。③核移胚以胚胎培养液NCSU23(NorthCarolinaStateUniversity23medium,北卡洲立大学培养液23)及卵丘颗粒单层共培养体系进行分别培养,核移胚卵裂率无明显差异(30.06%,31.5%,P>0.05)。但NCSU23培养4细胞后发育能力更高(13.5%,3.9%,P<0.05)。     

Effect of Oocytes in vivo and in vitro on the Developmental Potential of Porcine Somatic Cell Cloned Embryos

To investigate the impact of porcine oocytes in vivo and in vitro maturation (IVM) on the development of porcine somatic cell cloned embryos,the somatic cell cloned embryos cultured in vitro and the sows were treated with hormones to collect mature oocytes in vivo,and the cleavage rate, blastocyst rate and embryo implantation were compared. The results showed that the average number of ovulation in PGC+PMSG+HCG group was significantly higher than that of PGC+HCG,PMSG+HCG and the natural estrus groups (P<0.05). The oocytes collected in vivo could be used for the construction, and the available oocytes rate reached more than 90%,and there was no significant difference among the four groups (P>0.05),which indicated that groups treated by hormone could obtain more available oocytes and the quality of oocytes was not significant different. In vivo and in vitro matured oocytes were used as nuclear transfer embryos of recombinant receptor,the fusion efficiency (80.31% and 79.29%) and cleavage rate (90.40% and 86.51%) were not significant different (P>0.05), but the proportion of in vivo matured oocytes cloned embryos developed into the blastocyst stage was significantly higher (P<0.05). The reconstructed embryos made from in vivo and in vitro matured oocytes were transplanted into surrogate sows (transferred 30 or 60 embryos),10 piglets were born in in vivo maturation of cloned embryo transfer group,while there was no implantation in in vitro maturation of cloned embryo transfer group. The results showed that high quality oocytes obtained by superovulation could significantly increase the blastocyst rate of embryos,reduce the number of embryos transferred and improve the pregnancy rate of surrogate sows.     

卵母细胞核因子促进核移植四倍体胚胎早期发育研究

研究旨在探讨猪卵母细胞核因子在重编程过程中发挥的作用。将体细胞引入未去核的MⅡ期卵母细胞中,构建体细胞核与卵母细胞核共存的核移植四倍体胚胎。通过分析核移植四倍体胚胎的早期发育情况探讨卵母细胞核因子对核移植四倍体胚胎早期发育的影响。结果显示,核移植四倍体胚胎、孤雌二倍体胚胎及孤雌单倍体胚胎这3组胚胎的卵裂率极显著高于核移植二倍体胚胎（P<0.01）,且核移植四倍体囊胚率及总细胞数也极显著高于核移植二倍体囊胚（P<0.01）。与通过标准核移植程序构建的核移植二倍体胚胎相比,核移植四倍体胚胎具有更强的发育能力。本研究建立了一个体细胞核与完整卵母细胞核因子物质共存的四倍体胚胎模型,有助于研究供体核与卵母细胞核之间的联系,为研究核因子在重编程过程中发挥的作用提供了平台。     

Study on Oocyte Nuclear Factor Promotes the Early Development of Tetraploid Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos

The study was aimed to investigate the role of porcine oocyte nuclear factors during reprogramming. Somatic cell nuclei was introduced into intact MⅡ oocytes to establish tetraploid somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos containing both somatic nuclei and oocyte nuclei. And then the influence of the oocyte nucleus on tetraploid SCNT embryo development was examined by assessing characteristics including cleavage rate and blastocyst rate. The results showed that the cleavage rate of tetraploid SCNT embryos,diploid parthenogenetic embryos and haploid parthenogenetic embryos was extremely significantly higher than that of standard diploid SCNT embryos (P<0.01). The blastocyst rate and the total number of cells in tetraploid SCNT embryos were extremely significantly higher than that of standard diploid SCNT embryos (P<0.01).Overall,tetraploid SCNT embryos had a higher developmental competence than standard diploid SCNT embryos. In conclusion, the embryonic model was established in which a fetal fibroblast nucleus and an oocyte M Ⅱ plate coexist. Tetraploid SCNT represented a new research platform that was potentially useful for examining interactions between donor nuclei and oocyte nuclei. This platform should facilitate further understanding of the roles played by nuclear factors during reprogramming.     

体细胞克隆猪的研究与展望

用体细胞核移植的方法生产的克隆猪诞生至今已近5年，虽然同胚胎细胞核移植相比，体细胞核移植技术难度大，成功率低，但近年来用体细胞核移植技术克隆猪有了更深入的研究，在体细胞核移植基本机理和关键技术上取得了一定的进展。综述了用核移植的方法生产体细胞克隆猪的技术关键和难点及应用情况，并对提高猪体细胞核移植效率的策略进行了分析。