转Bt基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究Ⅱ.Bt杀虫晶体蛋白抗体的制备

用碳酸钠裂解液(50mmol/LNa2CO3,50mmol/LEDTA,pH10)从BacillusthuringiensisHD-1的孢晶混合物中分离提取杀虫蛋白的基础上,进一步用聚丙烯酰胺凝胶制备电泳技术纯化杀虫蛋白,获得了高纯度的杀虫蛋白作为抗原,用于免疫家兔制备抗体。比较了不同抗原注射剂量的免疫效应和免疫过程中(不同注射时间)抗体生成量的变化。结果表明,供试的二种抗原注射剂量对抗体的效价无明显影响,随着免疫次数的增加抗体效价不断上升,最终获得了用琼脂双扩散测定效价为1/120的抗血清。Bt杀虫蛋白的免疫原性低。抗血清中的抗体免疫球蛋白(Ig),首先经硫酸铵分级沉淀粗提,再用DEAE-52纤维素柱层析提取纯化,获得了高纯度的IgG,为抗体的酶标记和ELISA检测杀虫蛋白等研究提供了高特异性的Bt抗体。研究的结果为Bt菌HD-1杀虫蛋白抗体的制备提供了依据。     

大型溞胆碱酯酶间接非竞争酶联免疫吸附定量分析法的建立

用达到电泳纯的大型溞(Daphniamagna)胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)免疫BALB/c小鼠,得到效价达1∶8000的鼠抗大型溞ChE多克隆抗血清;通过优化抗原抗体反应条件,建立定量分析大型溞ChE含量的间接非竞争酶联免疫吸附法(indirectandnon‐competitiveenzyme‐linkedimmunosorbentassay).结果表明:此方法检测灵敏度为24ng爛mL-1;经免疫交叉反应鉴定,所获抗血清与5、10μg爛mL-1标准蛋白质和其他生物如花翅摇蚊、尖额溞、斑马鱼(脑、脑除外的整体)、家蚕、意大利蜜蜂、赤子爱胜蚯蚓、非洲爪蟾(蝌蚪)等来源的ChE交叉反应率分别为:<0畅25%、<0畅25%、 2畅13%、 10畅19%、3畅88%、 3畅56%、 2畅81%、 3畅93%、 5畅00%和2畅75%,具较高的特异性.说明用本试验得到的抗血清建立的间接非竞争酶联免疫吸附法可用于大型溞体内ChE含量的测定,以利于在农药暴露环境下大型溞体内ChE活性的精确检测.     

转Bt基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究Ⅰ.Bt菌HD-1的杀虫晶体蛋白抗原制备

研究了培养时间对苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)HD-1菌株孢晶混合物的产量、杀虫晶体蛋白裂解液的种类和处理温度与时间对杀虫晶体蛋白提取率及纯度的影响。结果表明BtHD-1菌株在Bt生长繁殖平板培养基上,30℃下培养41～55h均可获得大量孢晶混合物。采用50mmol/LNa2CO3裂解液处理孢晶混合物,可获得纯度高的130kD杀虫晶体蛋白,而用40mmol/LNaOH提取的杀虫晶体蛋白中含有较多杂蛋白。所研究的处理温度和时间对杀虫晶体蛋白提取量和组成无明显影响。这些结果为杀虫晶体蛋白抗原的制备提供了依据。     

酶联免疫(ELISA)分析晋麦叶片中脱落酸的含量

[目的]为了研究低温处理和外施脱落酸(ABA)对晋麦叶片中ABA含量的影响,为引进和推广小麦品种提供参考。[方法]通过低温处理和外施脱落酸,采用酶联免疫法(ELISA)测定晋麦47叶片中内源ABA含量的变化。[结果]经外源ABA处理的晋麦47叶片的ABA含量比对照增加3.16 ug/g;低温处理的晋麦47叶片的ABA含量比对照增加了2.105 ug/g。[结论]通过对两种处理的比较可发现,外施ABA对晋麦47叶片中ABA含量的影响比低温处理更为明显。     

基于单克隆抗体的酶联免疫法与高效液相色谱法检测水产品中环丙沙星残留的比较

为了快速、灵敏地检测禁用药物环丙沙星在水产品中的残留,建立了基于单克隆抗体的间接竞争酶联免疫法(competitive indirect ELISA,ci-ELISA),并比较了其与高效液相色谱法(High Performance LiquidChromatography,HPLC)在灵敏度、准确性和重现性等方法学参数上的差异。实验结果显示,经过浓缩、净化等前处理过程,ci-ELISA与HPLC的检测灵敏度分别可以达到10μg/kg和1μg/kg,回收率分别为79.28%~92.92%和86.27%~97.32%,相对标准偏差分别在3.21%~8.88%和2.66%~5.52%。前者经济、高效,适合作为初筛方法大批量筛选样品;后者灵敏度、重现性更好,适于在实验室条件下作为验证方法。     

不同pH值对酶联免疫法检测生猪尿样中瘦肉精含量的影响

意大利试剂盒与三方圆试剂盒检测生猪尿样的瘦肉精含量及pH值,试验结果表明,在一定pH值范围内瘦肉精含量与样品pH值呈极显著负相关关系;不同试剂盒对样品的pH值要求不同,样品pH值的变化对其检测结果影响的总体趋势相同,但影响程度不同;在试剂盒所对应的推荐pH值范围以内,样品pH值的变化对检测结果的影响较小,反之,样品pH值每调节1个单位所得的检测结果间显著差异。     

酶联免疫法检测猪肝中β-兴奋剂残留的不确定度分析

[目的]分析酶联免疫法检测猪肝中β-兴奋剂的不确定度,探讨各因素对检测结果的影响。[方法]参考JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》和CNAS-GL06《化学分析中不确定度的评估指南》规定的基本方法和程序,分析了影响测量不确定度的来源,并对各不确定度分量进行了评估。[结果]当猪肝中β-兴奋剂含量为187.64 ng/kg时,其扩展不确定度为6.68 ng/kg(k=2)。[结论]影响检测结果不确定度的主要因素为回收率和标准曲线拟合,在实际测量过程中严格控制试验条件可提高酶联免疫检测的准确性和可靠性。     

酶联免疫法检测水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ残留量的影响因素及控制方法

酶联免疫法(ELISA)检测水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ残留量具有简单、快速、处理量大、灵敏度高、特异性强等优点。但由于此法影响因素较多,通过控制样品采集保存、试剂的制备、样品的前处理、洗板等关键步骤进行控制,减少误差,提高检测方法的灵敏度、准确度、精密度,提高检测结果的准确性和重现性。     

基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A方法与酶联免疫法的对比研究

[目的]比较基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A(OTA)方法与酶联免疫法。[方法]建立核酸适配体检测OTA标准曲线,进行样品加标回收率试验,并与酶联免疫法进行比较。[结果]核酸适配体法检测OTA在0.05～10.00 ng/mL具有较好的线性,饲料样品中添加OTA的回收率为92.0%～93.5%,与酶联免疫法相比,2种方法之间具有较好的一致性。[结论]该研究建立的基于核酸适配体检测OTA方法灵敏度高、准确度好,为研究饲料中OTA的快速检测方法奠定基础。