鸭圆环病毒ORF3基因的克隆及序列分析

为了解鸭圆环病毒(DuCV)不同分离株ORF3基因变异情况及分析其同源性,本研究从临床病料中分离10株DuCV,扩增ORF3基因并测定其序列.通过与已知序列比对分析发现,DuCV ORF3基因分为两种基因型,大小分别为237 bp和297bp.ORF3基因同一基因型之间的核苷酸同源性为95.8％～100％,氨基酸同源性为88.6％～100％,而不同基因型之间的核苷酸同源性仅为87.8％～91.6％,氨基酸同源性仅为72.2％～81.0％.     

Development of a polymerase chain reaction procedure for detection and differentiation of duck and goose circovirus

This article reports the complete nucleotide sequences of four duck circovirus (DuCV) isolates from sick ducks in Taiwan and development of a polymerase chain reaction (PCR) for detection and differentiation of goose circovirus (GoCV) and DuCV. Sequence comparison showed that Taiwanese DuCV isolates had 82.5%-83.8% nucleotide sequence identity to the German and North American DuCV isolates. This is the first report on the presence of DuCV and its associated diseases outside Germany. A PCR test was developed using a universal primer pair based on conserved sequences present in the genomes of GoCV and DuCV. This PCR test could detect and differentiate between GoCV and DuCV by the size of PCR product each virus produced (256 bp for GoCV and 228 bp for DuCV). Application of this PCR test to samples of bursa of Fabricius from sick birds in the field showed that 9 of 26 goose samples contained GoCV, while 13 of 34 duck samples contained DuCV. This PCR test could serve as a fast and sensitive method for detection and differentiation of DuCV and GoCV.     

鸭圆环病毒基因组序列分析及其C1截短基因的原核表达

本试验参照GenBank登录的鸭圆环病毒(DuCV)基因组序列,设计2对DuCV特异性引物,运用PCR方法从病死番鸭法氏囊中分段扩增出DuCV LJ07株基因组,将扩增片段分别克隆获得重组质粒,测序后得到全长为1 995nt的DuCV LJ07株全基因组序列,与GenBank登录的DuCV基因组序列的同源性迭83.6%～96.5%.经基因结构分析发现,DuCV LJ07株的基因组有6个开放阅读框(ORF),其中V1、C1是2个最主要的ORF,分别编码Rep蛋白和Cap蛋白;在V1和C1的5'起始端之间有与启动滚环复制有关的一茎环结构和2个正向重复序列.本试验同时还构建了去除核定位信号的C1截短基因的原核表达载体,诱导表达后经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明C1截短基因已成功地在大肠杆菌中表达出Cap截短蛋白,为建立DuCV抗体血清学检测方法和开展DuCV感染的血清学调查奠定了基础.     

2019年我国部分地区鸭圆环病毒基因序列测定与分析研究

为了解近年鸭圆环病毒流行毒株的基因遗传特点和变异情况,通过采用PCR的方法对我国部分地区的30份鸭圆环病毒阳性样品进行全基因组扩增与克隆、序列测定及遗传进化分析。结果显示:30株DuCV流行毒株之间的全基因序列同源性为85.8%~99.9%,其中26株DuCV的全基因序列长为1993~1995 bp,与德国代表株处于同一进化分支,属于基因1型,4株DuCV的全基因序列仅有1988 bp,与中国台湾代表株属于同一进化分支,属于基因2型;Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列的变异分析表明Cap蛋白的变异程度要显著高于Rep蛋白。     

鸭圆环病毒PT07基因组序列测定与分析

本研究采用PCR方法从临床健康的番鸭法氏囊组织中分段扩增获得鸭圆环病毒(DuCV)PT07全长基因组,将扩增片段分别克隆,获得重组质粒,测序结果表明,DuCV基因组全长为1988nt。经基因组结构分析发现,DuCVPT07的基因组有3个开放阅读框(ORF),其中V1/rep和C1/cap是2个主要的ORF,分别编码Rep蛋白和Cap蛋白;在V1/rep和C1/cap的5'起始端之间存在与启动滚环复制有关的1个茎环结构和1个正向重复序列。遗传进化分析发现,DuCV可分为2个群,PT07与TC1/2002～TC4/2002和FJ0604同处一个进化分支,而与Ger、33753-52和MH25关系较远。     

分子标记株鸭圆环病毒感染性核酸的构建

以临床分离的鸭圆环病毒（duck circovirus）（GenBank登录号：GU168779）阳性病料为材料,根据GenBank中所登录的鸭圆环病毒基困序列设计引物并对设计的引物5′末端进行磷酸化处理,通过引物设计替换碱基,以突变形成EcoRⅠ酶切位点。利用PCR方法扩增鸭圆环病毒的基因,经胶回收后,用T4 DNA连接酶进行环化,以获得鸭圆环病毒具有感染性的核酸。在含有分子标记的两端设计引物,进行PCR扩增,对PCR产物进行胶回收,连接T载体后测序,对胶回收产物进行EcoRⅠ酶切鉴定,均证明在第587位成功插入EcoRⅠ酶切位点。结果表明,本试验已成功构建带有分子标记的鸭圆环病毒的感染性核酸,为进一步开展该病毒的分子调控机制、致病性和开发基因工程疫苗研究奠定基础。     

2018-2020年广东鸭圆环病毒流行病学调查

为调查广东省鸭圆环病毒(DuCV)流行情况,本研究根据已报道的PCR方法,对2018年12月-2020年7月采自广东省9个不同地区的910份临床鸭组织病料进行鸭圆环病毒(DuCV)、大肠杆菌(E.coli)、腺病毒(FAV)、细小病毒(DPV)、禽流感病毒(AIV)和鸭坦布苏病毒(DTUMV)检测。结果表明:DuCV总检出率为23.18%(211/910);2019年第三季度较高,为34.61%;DuCV单重感染为16.24%(32/197),二重感染和三重感染分别为62.43%(132/197)和21.31%(42/197)。研究结果表明,DuCV在广东省鸭养殖场中存在不同程度的流行,夏季和冬季为多发,DuCV的感染会造成免疫抑制进而导致其他病原的感染,加重疾病的严重程度和死亡率。本研究调查结果为广东省养殖户了解广东地区DuCV的流行态势提供可支撑的数据。     

河南省樱桃谷鸭乙型肝炎病毒全基因组克隆与序列分析

对河南省樱桃谷鸭主产区信阳、新郑、焦作三地628份樱桃谷鸭血清样本应用PCR技术进行鸭乙型肝炎病毒（DHBV）检测,并将三地DHBV阳性样本各挑选1份进行DHBV全基因的扩增、克隆、测序及序列分析。结果显示,信阳、新郑、焦作三地樱桃谷鸭DHBV自然携带率分别为10.5%、8.9%、17.6%;3株DHBV基因组全长分别为3 021、3 027、3 024bp,均含有编码P、S和C蛋白的3个开放阅读框,各开放阅读框氨基酸同源性比较显示差异显著的区域位于P蛋白。序列分析显示,3株DHBV河南株核苷酸同源性为89.8%~93.9%,与参考株为89.4%~99.5%。遗传进化分析及P蛋白关键位点分析结果表明,信阳分离株为西方基因型,其余2株为中国基因型。本试验掌握了河南省樱桃谷鸭主产区DHBV自然感染情况,并成功克隆了3株樱桃谷鸭DHBV全基因序列,为该病毒的进一步研究提供了有益信息。     

广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查

为了解广西鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)感染情况,根据已发表的鸭圆环病毒序列合成了1对PCR引物,利用该引物对采集于百色、柳州和桂林3个市的321份鸭组织样品进行了检测。结果表明,58份样品能扩增出228 bp的特异条带,总阳性率为18.07%;且3个市均能检出阳性样品,阳性率分别为18%（54/300）、5.6％（1/18）和100％（3/3）。结果证实,广西百色、柳州、桂林地区的鸭群中不同程度地存在鸭圆环病毒感染现象。     

鸭Ⅰ型禽副粘病毒YH99V株HN基因的克隆和序列分析

在浙江地区进行鸭病病因的调查过程中，从患病鸭群中分离到一株引起鸭产蛋锐减而不死亡的病毒，经鉴定该病毒属于禽副粘病毒Ⅰ型，命名为YH99V株。以YH99V株的基因组RNA为模板，通过RT—PCR一步法扩增出其HN基因的cDNA片段，然后将其克隆至pMD18-T载体中，对其进行序列测定。测序后拼接出HN基因的序列长度为1785bp，该基因的ORF总长为1734bp，编码577个氨基酸。将YH99V株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现，它们的核苷酸序列同源性分别在82．1％～99．7％，氨基酸序列同源性为87．2％～99．5％。在同源性比较的基础上，进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病调查有着重要的意义。     

An investigation of duck circovirus and co-infection in Cherry Valley ducks in Shandong Province, China

The co-infection of duck circovirus (DuCV) with Riemerella anatipestifer (RA) or/and Escherichia coli (E. coli) or/and duck hepatitis virus I (DHV-I) in Cherry Valley ducks in China's Shandong Province was investigated by using polymerase-chain-reaction (PCR)-based methods. For this study, 742 ducks sampled at random from 70 duck farms during 2006-2007 were examined using PCR and dot-blot hybridisation (DBH) tests. Overall the DuCV infection rate was 33.29%. Compared with those at 2 weeks of age, the ducks at 3-4 weeks of age were more susceptible to DuCV infection. Compared with the DuCV-negative ones, the DuCV-positive ducks had a higher rate of infection by DHV-I (25.5% vs. 7.475%), RA (23.48% vs. 8.28%) and E. coli (16.19% vs. 4.85%). This investigation shows that DuCV infection is common in Cherry Valley ducks on some farms in Shandong Province.     

鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank中鸭新城疫病毒(NDV)的F基因和鸭圆环病毒(DuCV)的V1/rep基因的保守序列,各设计一对特异性引物,并对二重PCR的扩增条件进行优化,建立了鸭NDV和DuCV的二重PCR检测方法。对混合样品进行扩增,得到2条大小为493bp(鸭NDV)和218bp(DuCV)的特异性条带,与预扩增片段相符。而对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原检测,结果为阴性。该方法的敏感性试验表明,鸭NDV的核酸最小量为40fg,DuCV为20fg。     

柑橘衰退病毒JY基因型分离株在我国的发生及其分子特征

柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）是对柑橘产业具有毁灭性危害的病原之一。为了明确JY基因型分离株在我国的发生及其分子特征,本研究对4个地区的野生柑橘和9个柑橘产区的栽培柑橘进行JY基因检测,并克隆测序JY 基因型分离物的ORF1b、p33、p25、p23基因进行分析。结果显示仅来自湖南江永自然生态中的46个道县野橘样品中检出12个阳性样品,说明JY 基因型在我国的发生分布并不广泛。ORF1b、p33、p25、p23基因序列多样性、遗传分化、分子变异分析表明,JY 基因型12个分离物间核苷酸和氨基酸序列相似性极高（>96.8%）,但JY 基因型分离物与CTV其他基因型分离物存在明显的遗传分化：ORF1b、p33、p25、p23基因序列的平均核苷酸和氨基酸序列相似性分别为79.2%-92.7%、80.8%-85.9%、90.5%-93.6%、87.5%-91.8%和89.5%-98.1%、80.8%-84.4%、93.7%-97.3%、85.4%-91.6%;Fst均明显高于0.25;CTV JY基因型种群与其他基因型种群的差异非常大（分子变异大于43%,P值为0.001）,且基因交流小（Nm=0.396）。ORF1b、p33、p25、p23基因单独及4个基因联合系统发育分析,表明JY 基因型12个分离物均与JY-2 聚集在同一簇,且独立于现有CTV基因型之外,进一步证实JY 基因型与CTV其他基因型分离物存在明显的遗传分化,可能为我国特有CTV基因型株系。     

鸭圆环病毒巢式PCR检测方法的建立及应用

鸭圆环病毒病给养鸭业造成严重的经济损失,鉴于此,本研究根据GenBank登录的鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)保守区基因组序列(登录号:NC_005053.1),设计合成内、外2对引物,通过PCR反应条件的优化,建立了检测DuCV的巢式PCR检测方法。该方法对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、新城疫病毒的扩增结果均为阴性;第1轮扩增的灵敏度为10 pg,第2轮扩增的灵敏度为0.1 pg,通过巢式PCR,敏感性提高了100倍。本研究建立的巢式PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以准确快速的用于鸭圆环病毒的病原检测。     

鸭圆环病毒LAMP可视化检测方法的建立

根据GenBank中DuCV基因序列,在保守区设计了6条特异性引物,并对反应条件进行优化,建立了一种适用于鸭圆环病毒（DuCV）的环介导等温扩增快速检测方法（LAMP）。该方法对H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎、鸭副黏病毒均无扩增反应;且扩增反应只需在常规水浴锅中进行,1小时内即可完成反应;对DuCV模版DNA的最小检测限为10龟,灵敏度是一步法PCR的1000倍。本研究建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行DuCV的快速检测。     

2007-2009年华南地区鸭肝炎病毒流行病学调查及分离株的VP1基因变异分析

为了分析华南地区鸭肝炎病毒（Duckhepatitisvirus,DHV）的遗传进化情况,本试验对2007～2009年华南地区各鸭场发病雏鸭进行DHV的病原学检测以及VP1基因扩增、克隆和测序,并运用生物信息学软件对VP1基因进行了序列分析。结果表明：所分离的R、SS1、ZJ株为DHV-A、VP1与DHV-A参考毒株核苷酸序列相似性分别为93．8％～100％、93．7％-99．6％、91．7％-98．9％,氨基酸序列相似性分别为94．5％～100．0％、94．1％-99．2％、95．0％-99．2％。其余15株DHV-C分离病毒株与台湾新型DHV核苷酸和氨基酸序列相似性均在71．4％～72．0％和78．2％-79．0％之间,与韩国新型DHV相似性在94．0％-95．1％和91．6％-93．3％之间,与国内分离的新型DHV相似性均在97．9％～100．0％和97．5％～100．0％之间。VPl氨基酸序列比对分析表明：VP1的高变区主要分布在46-64、95-149、180-223位,尤其是C’末端,存在点突变或连续变异。在第145-146位,15株新型DHV毒株此3株I型DHV多2个氨基酸（G和G）。小RNA病毒科的VPl蛋白中保守的RGD基序,在DHV中分别显示为SGD和QSD。结果表明,危害华南地区鸭场的DHV已经发生变异,且存在两种基因型毒株的流行。     

藏猪源捷申病毒的检测和遗传演化分析

旨在调查四川地区藏猪捷申病毒（porcine teschovirus,PTV）的流行及分子特征和遗传演化。用RT-PCR法对2017-2018年采自四川省甘孜藏族自治州康定市14个藏猪场96份粪便样品进行检测,并对全基因组进行序列分析和基因分型。PCR检测结果表明,PTV核酸阳性率为20.8%（20/96,95% CI=13.2%~30.3%）,14个规模藏猪场中PTV猪场阳性率为57.1%（8/14,95% CI=28.9%~82.3%）,并从2份阳性样本中获得了2条近似全长的PTV全基因组序列,分别命名为SWU-E5-2018和SWU-ZG2-2018,核苷酸序列相似性为83.1%。通过VP1序列分析发现2条序列的血清型分别为3型和6型。通过基因重组分析发现SWU-E5-2018存在重组现象,重组区域位于衣壳蛋白基因P1的552-3 082 nt处。为了进一步研究2条PTV序列的演化过程,以贝叶斯进化分析软件进行分歧时间估算,结果表明,SWU-E5-2018的分歧时间约为2010年,SWU-ZG2-2018的分歧时间约为2011年。本研究首次对藏猪源PTV进行了初步调查,结果表明藏猪中存在一定程度的PTV感染,为深入研究藏猪源PTV遗传变异及其生物学特性提供了参考依据。     

2005年-2010年我国部分地区PRRSV流行毒株的遗传变异分析

为了掌握高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,揭示该病的发生规律,根据GenBank登录的PRRSV基因序列设计引物,采用RT-PCR法对2005年-2010年间送检的282份病料进行了PRRSV核酸检测,对其中9份阳性样品进行了ORF5～7基因片段扩增和测序,所得序列与GenBank下栽的PRRSV...     

2014年-2016年广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2和ORF5基因的遗传多样性分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传进化情况,对2014年-2016年来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2和ORF5基因的扩增和测序分析.结果获得34个Nsp2基因序列和45个ORF5基因序列,均属于美洲型毒株.Nsp2基因间核苷酸序列的同源性为91.8％~100％,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为81.3％~84.3％、88.9％~92.1％、94.3％~99.3％和73.5％~75.1％,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为51.5％~53.2％.ORF5基因间核苷酸序列的同源性为82.8％~100％,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为83.7％~99.5％、85％~95％、83.8％~99.7％和83.2％~86.4％,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为62.4％~64.5％.基于Nsp2和ORF5基因推导的氨基酸序列绘制的遗传进化树中,广西地区的毒株主要分布在以JXA1为代表的Ⅳ亚群.表明当前广西PRRSV流行毒株以JXA1株为代表的高致病性美洲型毒株为主,各毒株Nsp2和ORF5基因序列存在一定的差异,尚未发现欧洲型毒株和美洲型NADC30类毒株.     

鸭圆环病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank发布的鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)序列(AY228555),运用Primer Premier 5.0设计2对引物,建立了适合DuCV快速检测的套式PCR方法,采用该方法对从安徽省望江县采集的发病鸭肝脏、胸腺、法氏囊、肾脏和脾脏等内脏病料进行DuCV检测。结果显示,套式PCR对所有内脏病料均能扩增出340 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝脏、鸭瘟病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、网状内皮组织增生病毒、鸡传染性贫血病毒、鸭源大肠杆菌和鸭疫里氏杆菌的扩增结果均为阴性;该方法第1次扩增的敏感性是1 ng,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高106倍;表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭圆环病毒(DuCV)感染的临床诊断和流行病学调查。