松材线虫携带的一株细菌分离及其致病性

从患松材线虫病致死的黑松和马尾松病树组织及松褐天牛虫体中分离的松材线虫虫体上均分离到同一细菌菌株 .经致病性、革兰氏染色、菌体形态、培养性状和生理生化反应等测定 ,将致病菌株鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌 .ATBExpression自动鉴定仪的鉴定结果与上述结果相同 .在分离过程中该菌出现频率较高 ,说明是松材线虫携带的主要细菌 .人工接种试验结果显示 ,用无菌线虫或洋葱伯克霍尔德氏菌菌株分别接种的黑松无菌苗不发病 ,而用二者混合接种则使无菌苗迅速发生褐变和萎蔫 .林间利用 6年生黑松进行的接种试验结果证明 ,用无菌松材线虫和洋葱伯克霍尔德氏菌菌株混合接种的黑松与使用野生松材线虫接种的黑松都 10 0 %的患病 .单独用无菌松材线虫接种有 4株发病 ,6株没有发病 .其中发病黑松中不仅分离到了松材线虫 ,也分离到了细菌 ,而没有患病的 6株黑松中仅分离到少量松材线虫 .这说明在野外条件下接种的松材线虫可以通过某种途径重新获得细菌 ,导致了接种的黑松患病 .而接种后无菌松材线虫没能获得细菌的那些黑松就没有患病 ,说明单独无菌松材线虫不能使黑松患病 .这些结果说明松材线虫携带的细菌与松材线虫的致病性有关 .因此 ,可以把松材线虫病看作是线虫和细菌共同侵染引起的一种植物复合侵染病害 .在这     

不同来源松材线虫携带的细菌多样性

对来自日本和中国的松材线虫所携带的细菌进行了分离、纯化培养,并通过菌落形态、氧化酶检测、接触酶试验,革兰氏染色和ABT自动检测等方法,确定了中国的松材线虫所携带细菌的主要种类为假单胞菌和泛菌属,而日本的松材线虫所携带的主要是产气肠杆菌、产吲哚金黄杆菌、葡萄球菌。     

松材线虫及携带细菌对黑松复合的侵染

从不同松树上分离松材线虫、拟松材线虫、滑刃线虫和小杆线虫,并从松材线虫和小杆线虫体上分离细菌,将线虫无菌化处理后与从线虫体上分离到的荧光假单胞杆菌、产气肠杆菌混合接种无菌黑松苗和愈伤组织。结果表明,单独接种无菌线虫或细菌不能使黑松致病,无菌松材线虫、无菌拟松材线虫只有与有毒性的荧光假单胞杆菌混合接种时才能使黑松无菌苗和愈伤组织发病,细菌通过线虫携带在树体内传播扩散,使松树致病。研究进一步证明了线虫和细菌在松材线虫病致病过程中起协同作用。     

松材线虫携带细菌的光镜观察与数量测定

首次用改进的染色方法对松材线虫携带的细菌进行了光镜观察，表明细菌存在于松材线虫的体表及线虫生活的环境中；同时采用平板计数法统计了线虫虫体上携带的细菌数量，平均每头线虫为170-280个细菌。这进一步证实了松树的萎蔫是由松材线虫及其携带的细菌造成的。     

松材线虫拮抗细菌的筛选

[目的]筛选对松材线虫(Bursaphelenchuh xylophilus)具有杀线活性的细菌。[方法]对来自松、杨林分的12株细菌进行了杀松材线虫活性测定。[结果]在植物体上共分离获得12株细菌,其中JK-SD001发酵液稀释4倍对松材线虫处理24 h后杀线率仍为100%,且松材线虫虫体出现消解现象,消解率为80.4%。[结论]为开发生物源杀线剂奠定了基础。     

宁波松木中松材线虫与拟松材线虫混生现象的报道

在对宁波地区松木中携带的伞滑刃属线虫种类进行调查时,多次发现了松材线虫与拟松材线虫混生的现象,并进行了分子生物学方法的确认。     

松材线虫伴生细菌与松材线虫的关系及致病性机理研究

松材线虫病又称松树萎蔫病,近年来成为了国内严重毁坏型病害。如何治理该病害成为了当今植物保护界研究热点,降低该病害对生产造成的损失尤为迫切,现通过对松材线虫病的危害进行分析,总结前人对松材线虫病的研究成果:分析松材线虫伴生细菌的多样性,发掘松材线虫伴生细菌与松材线虫的关系,结合国内外研究松材线虫伴生细菌的致病性机理研究,总结得出松材线虫伴生菌种较多,没有明显的专一性,结合微生物细菌研究的发展,分离和鉴定出越来越多的细菌种类;指出了松材线虫与携带细菌之间存在密切相关,毒素在松材线虫伴生细菌的致病机制中起着重要作用。     

美国松材线虫体表携带优势细菌的鉴定及致病性

为证实松材线虫Bursaphelenchus xylophilus虫株携带弱毒细菌替代强毒株系防治松树萎蔫病这一思路的可行性,从2个美国松材线虫虫株体表分离并确定了优势细菌,测定了各优势细菌的毒性和致病性．并对这些菌株进行了初步鉴定。细菌分离结果显示：MG4,MG5,MG8和MG9等4菌株为美国线虫体表的优势菌株。毒力测试表明．与中国松材线虫携带的强致病菌相比,美国松材线虫携带的4个菌株的产毒能力和致病性均较低．可以作为生防细菌的候选菌株使用。经细菌的常规染色、形态学观察及16SrDNA序列分析,MG4,MG5,MG8和MG9菌株分别被鉴定为代夫特茵Deftia tsuruhatensis,恶臭假单胞茵Pseudoinonas putida,嗜麦芽窄食单胞茵Stenotrophomonas maltophilia和泛菌属1种Pantoea sp．。图2表3参20     

松材线虫产生的分泌物对松树的致病作用

用多毛孢(Pestalotia sp.)培养松材线虫,经过表面消毒后,在Tris-HCl缓冲液中振荡培养,培养液经硫酸铵沉淀、透析、冷冻真空干燥,制成的干样,用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。松材线虫能向体外分泌多种可溶性蛋白,发现有纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶。用松材线虫产生的分泌物、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶接种3年生黑松(Pinus thunbergii),发现松材线虫产生的分泌物和纤维素酶能够导致松针枯死。这暗示松材线虫的分泌物可能是松材线虫病因之一。     

不同松材线虫虫株致病性的比较分析

松材线虫萎蔫病是由松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus（Steiner＆Buhoror）Niclde]引起的松属树种上一种毁灭性的病害,目前对该病的致病机理尚不十分清楚。本研究采用松材线虫的6个虫株和拟松材线虫的1个虫株对1年生黑松苗进行致病性测定。结果表明,1、6号虫株致病性较强;2、5号虫株致病性较弱;3号和4号致病性居中。6个虫株的松材线虫最终都能导致黑松死亡,拟松材线虫不具有致病性。     

利用荧光PCR快速检测松材线虫

利用荧光PCR从美国进境的木质包装材料中成功检出松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus).结果表明,探针检测松材线虫样品时,可产生明显的荧光信号,但空白水对照、小杆线虫(Rhabditida)、拟松材线虫(B.mucronatus)无荧光信号,表明探针有较强的特异性,且具有简单、灵敏、快速等特点.     

中国与美国松材线虫体表细菌在线虫体表对峙及对松苗致病性

松材线虫体表的细菌存在演替现象,美国松萎蔫病危害不严重的原因可能是松材线虫体表细菌演替的结果。利用美国线虫体表的细菌来替代中国线虫体表的细菌,从而降低中国松萎蔫病的流行,为松萎蔫病的生物防治提供了可能。为此,本研究从3株美国松材线虫体表分离得到15株细菌菌株,并确定MG3、MG4、MG5、MG8、MG9、MG11、MG12为优势菌株。用中国松材线虫体表的4个致病细菌菌株YG1、YG2、YG3、YG4分别和15株美国菌株在实验室条件下进行对峙,发现美国MG4、MG5、MG8、MG9等菌株在松材线虫体表具有很强的竞争能力。用竞争能力最强的3个美国菌株MG5、MG8、MG9,混同无菌松材线虫分别对黑松、马尾松、湿地松和油松进行接种,发现相对于中国YG2菌株,美国菌株MG8和MG9对4种松树的致病性均明显较低。提出美国菌株MG8和MG9可以作为生物防治的候选菌株。      

杀灭松材线虫的高效药物筛选与毒性测定

为筛选出对松材线虫Bursaphelenchus xylophilus具有高效快速杀灭作用的药物,采用线虫悬浮液 + 农药的直接触杀法,选择了22种药物处理松材线虫1 h,测定了对松材线虫的半致死浓度（LC₅₀）。结果表明：不同药物对松材线虫表现出不同的杀灭作用,供试的22种药物中,甲基阿维菌素（甲维盐）杀灭效果最好,1 h 半致死浓度仅为0.3 mg·L^－1;杀螟丹效果最差,1 h 半致死浓度达21 053 mg·L^－1。另外,苦参碱、抑太保、溴氰菊酯和阿维菌素等4种药物对松材线虫具有很强的毒杀作用,其1 h半致死浓度分别为1.2,2.5,4.2和4.5 mg·L^－1。甲维盐和阿维菌素能高效快速杀灭松材线虫;这些对松材线虫高效敏感药物的筛选成功,为开发树干注射剂防治松材线虫病提供了基础。图1表3参25     

松材线虫携带细菌在疫区和寄主中的分布及致病性研究

作者在江苏、上海、广东、安徽、湖北、浙江等疫区 ,采集了呈现松材线虫病典型症状的黑松、马尾松的病样 ,采用病木组织分离法 ,分离获得松材线虫所携带的细菌菌株 2 4株 ,经鉴定 ,2 4株细菌中 ,假单胞菌属有 11株 ,泛菌属有 6株 ,其余有不解糖消化链球菌、河生肠杆菌、乡间步丘菌和粘质沙雷菌 .由此可知 ,假单胞菌和泛菌分布较广 ,在所有采样疫区感染松材线虫病的马尾松和黑松病死木中都能分离到 ,是普遍存在病木组织中松材线虫携带的主要细菌 .致萎活性测定结果表明 :所有假单胞菌属和泛菌属的菌株对无菌黑松切根苗均有致萎活性 .用假单胞菌和泛菌分别与无菌松材线虫混合接种室内无菌黑松苗和野外多年生黑松 ,结果表明 :用细菌单独接种 ,无菌黑松苗和野外黑松均不发病 ,无菌松材线虫单独接种的无菌黑松苗和野外黑松也不发病或发病轻、慢 ,无菌线虫和致萎细菌二者混合接种能使无菌黑松苗和野外黑松发病快且严重 .由此认为松材线虫携带到寄主组织中的假单胞菌和泛菌属的一些种对松材线虫病有明显的协同作用     

假单孢菌毒素对黑松松针细胞防御酶系统影响

用不同浓度的假单孢菌Ⅱ型(Pseudomonassp.biotypeⅡ)毒素液处理黑松松针,按时间顺序测定与细胞防御酶系统有关的酶活性和可溶性蛋白含量的变化.结果表明:1)经原液和稀释5倍毒素液处理24 h的黑松松针的苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性均高于对照且达到最大值,此后原液处理的黑松松针酶活性有逐渐下降的趋势,稀释5倍处理的酶活性保持不变.2)经原液和稀释5倍的毒素液处理24 h的黑松松针超氧化物歧化酶(SOD)酶活性达到活性高峰,与对照值的差异显著.3)毒素使过氧化物酶(POD)活性有逐渐上升的趋势,稀释5倍和原液处理的毒素液对黑松松针POD活性的影响基本相同,在处理72 h内活性一直为升高状态.4)经毒素处理后黑松松针多酚氧化酶(PPO)活性增加,但稀释5倍的毒素诱导其活性较原液增加得快,活性高峰出现得早.5)可溶性蛋白含量:经毒素处理后黑松松针内可溶性蛋白含量较对照处理的含量有所增加.