显性白毛调控基因(KIT)与绵羊毛色关系的初探

[目的]研究显性白毛调控基因K／T与绵羊毛色的关系。[方法]应用RT-PCR技术克隆绵羊显性白位点基因KIT的exon2。并将exon2编码的氨基酸序列与其他动物进行同源性比较。[结果]绵羊Ⅺ丁基因exon2eDNA长271bp,编码86个氨基酸;同源性比较结果表明,绵羊与黄牛、水牛和山羊的同源性较高,迭98％～100％,而与马、狗、猪、猫等同源性仅为81％一88％。[结论]该研究结果为加快绵羊育种进展提供了理论依据。     

徐淮山羊PPAR基因cDNA的克隆和生物信息学分析

为克隆徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体(PPAR)基因的cDNA,探讨徐淮山羊PPAR基因的生物信息学功能.根据GenBank中发表的绵羊PPAR基因序列,设计并合成1对引物,采用RT-PCR方法克隆徐淮山羊脂肪组织中PPAR基因cDNA,提交GenBank,并运用DNAStar软件及在线工具进行生物信息学分析.成功克隆出徐淮山羊PPAR基因的编码区全序列cDNA,大小为1 428 bp,GenBank登录号为GU082382,有起始密码子ATG和终止密码子TAG,编码475个氨基酸;徐淮山羊PPAR基因序列与鸡、鼠、猪、牛、绵羊相应编码区(CDs)的同源性分别为81%、89%、92%、98%、99%,徐淮山羊PPAR氨基酸序列与鸡、鼠、猪、牛、绵羊的PPAR氨基酸序列同源性分别为92.9%、97.3%、98.3%、99.6%、99.8%;PPAR蛋白无信号肽区域,属于非分泌型蛋白.     

哺乳动物白色基因座(KIT基因)的研究现状

哺乳动物的毛色是由真黑色素及伪黑色素构成的,二者编码的蛋白在细胞内的相对含量决定了最终的毛色表型。黑色素的生物合成与经典的白色位点编码的KIT受体密切相关,KIT基因的突变会降低干细胞生长因子受体的活性。综述了KIT基因的作用机理、不同哺乳动物KIT基因的定位、突变分析、KIT基因对毛色的影响及在动物生产中的研究意义。     

绵羊YAP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆绵羊YAP1基因cDNA并分析其序列及其蛋白的遗传特性及其在不同组织中不同程度的表达情况。【方法】以湖羊为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术获得绵羊YAP1序列,并结合生物信息学方法对绵羊YAP1的序列进行深入分析。【结果】从湖羊背最长肌中克隆YAP1基因的全长cDNA序列;利用生物信息学技术,对绵羊YAP1基因与其它物种的同源性,蛋白质序列的跨膜区,亚细胞定位,亲水性,潜在信号肽剪切位点,糖基化位点,磷酸化位点,编码产物进行功能预测分析,及其编码蛋白的二级结构,三级结构等进行分析。【结论】克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1 712 bp,包括1 212 bp的编码区序列,编码403个氨基酸。同源性分析发现,绵羊YAP1核苷酸序列与推测氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高,分别达到78.77%和92.51%,而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为水溶性蛋白,相对分子量为44079.0Da,理论等电点为4.91,无信号肽序列和跨膜区;亚细胞定位主要在细胞核,不属于分泌蛋白;预测含有33个磷酸化位点,7个糖基化位点,具有两个WW结构域,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示,YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨YAP1基因在肌肉生长过程中的功能研究奠定了遗传信息基础。     

麦洼牦牛Toll样受体1基因的克隆及生物信息学分析

【目的】克隆并分析高原牦牛Toll样受体1基因(TLR1)的特点。【方法】提取麦洼牦牛脾脏RNA,反转录合成cDNA,以其为模板分段扩增后拼接获得麦洼牦牛TLR1基因编码区序列,采用相关分析软件对基因进行序列分析,并对其编码的蛋白质进行基本理化性质分析及预测。【结果】分段扩增获得了TLR1基因1 484bp的上游序列和823bp的下游序列,拼接后获得2 287bp的cDNA序列。TLR1基因系统进化树及同源性比对结果表明,TLR1基因极其保守,牦牛TLR1基因与黄牛、绵羊等哺乳动物遗传距离很近。预测TLR1基因含有1个2 184bp的开放阅读框,编码727个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为83.148 7ku;预测TLR1蛋白在第500~600位氨基酸区域含有1个疏水区域,结合跨膜区预测认为该疏水区域可能是TLR1蛋白的一个跨膜区,TLR1蛋白二级结构主要以α-螺旋及自由卷曲为主。【结论】TLR1基因在高原牦牛与平原哺乳动物之间存在较高的同源性,这可能与TLR1蛋白重要的生理功能相关。     

扩展莫尼茨绦虫β微管蛋白基因的克隆及序列分析

[目的]从扩展莫尼茨绦虫中克隆β微管蛋白基因,进行序列测定和生物信息学分析,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获得其全长cDNA序列;采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白二级结构的初步预测.[结果]获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因——β微管蛋白基因,全长1571 bp,编码444个氨基酸,与日本血吸虫的β微管蛋白氨基酸序列具有78.6;的同源性.编码蛋白的理论分子量为49.6 ku,等电点为4.96;1 -4位氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,140～146位GGGTGAG存在一个微管蛋白标志信号片段,在99～106位和391～410位存在两个典型的β微管蛋白保守区;亚细胞定位分析其为细胞的骨架蛋白.[结论]获得了扩展莫尼茨绦虫β微管蛋白基因的全长cDNA序列,为该基因功能的实验性鉴定工作奠定基础.     

绵羊LDHAL6A基因的电子克隆与生物信息学预测

以人LDHAL6A基因的cDNA序列为探针,利用生物信息学方法,对绵羊LDHAL6A基因进行了电子克隆,并对推导出LDHAL6A基因编码的蛋白结构与性质进行了预测。结果表明：绵羊LDHAL6A基因的cDNA序列全长为1798bp,包括999 bp的编码区和149bp的5ˊ非翻译区（5ˊUTR）、650 bp的3ˊ非翻译区序列（3ˊUTR）,编码合成332个氨基酸的多肽;其编码蛋白属疏水性蛋白,不存在信号肽及跨膜结构,定位于内质网上;无规则卷曲、琢-螺旋是绵羊LDHAL6A蛋白主要的二级结构元件。绵羊LDHAL6A基因编码蛋白可能在精子生成过程中起重要作用。     

扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白(PICK1)基因的克隆及序列分析

[目的]分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Monieziaexpansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测.[结果]获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因蛋白激酶C相互作用蛋白,全长1 527 bp,编码447个氨基酸,CDS预测存在明显的BAR,PDZ结构域.编码蛋白的理论分子质量为50.173 3 ku,等电点为5.22.[结论]获得了扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础.     

绵羊Noggin基因的克隆、序列分析与原核表达

根据同源序列克隆原理设计一对引物,以绵羊脑组织总RNA的反转录产物为模板,利用RT-PCR扩增绵羊Noggin基因cDNA全长编码区,克隆到pMD-18T载体。测序验证后,提取pT-Noggin质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收目的条带,亚克隆到pET41a原核表达载体,转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。序列分析表明,绵羊Noggin基因的cDNA全长编码区(GenBank登录号为FJ751853)为699bp,编码232个氨基酸,与其他哺乳动物氨基酸序列同源性达到95%以上。SDS-PAGE结果显示,诱导表达的融合蛋白大小为60ku,与预期蛋白大小一致。Western blot检测结果显示,该蛋白为His融合蛋白。说明成功克隆了绵羊Noggin基因的编码区序列,构建了原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白。     

绵羊激活素受体 IIB（ActRIIB）基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]旨在克隆绵羊激活素受体 IIB （ActRIIB）基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总 RNA反转录得到的 cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊 ActRIIB基因的 cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体 pET41a连接,构建重组表达质粒 pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1564 bp（ Genbank登陆号为：JX422071.1）,最大开放阅读框为1539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高（99.6%）,ActRIIB的 C末端区域高度同源且属于 TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小（约92 kD）并带有组氨酸标签序列的 ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊 ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

绵羊Nanog基因部分编码序列的克隆及分析

利用NCBI中GenBank里查询到已登录的人、猪、牛和山羊的NanogmRNA序列,通过多重同源比较,获得高度保守区域序列,设计了同源引物,并首次对绵羊Nanog部分编码序列进行了分子克隆。经过PCR扩增,获得绵羊Nanog基因第二外显子168 bp(GenBank Accession:EF436277)、第四外显子124 bp(GenBank Acces-sion:EF596905)和第二外显子至第四外显子498 bp(GenBank Accession:EU016097)三个序列片段。经测序,三个序列已登录GenBank。绵羊Nanog第二显子168 bp与山羊相应序列相似性最高达97%,与人相应序列相似性最低达84%;绵羊Nanog第四显子124 bp与山羊相应序列相似性最高达100%,与人相应氨基酸序列相似性最低达73%;经判断,绵羊Nanog第二外显子至第四外显子498 bp序列片段应该是一段假基因序列,与山羊mRNA相应序列相似性最高达98%,与人mRNA相应序列相似性最低达83%。本研究为进一步研究绵羊Nanog基因表达谱提供了序列信息。     

牦牛心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛H-FABP基因进行克隆和序列分析，以期为进一步开展牦牛该基因与其肉质性状的相关分析，进行分子标记辅助选择以及基因定位、表达等研究提供理论基础。【方法】用特定引物对牦牛H-FABP基因进行PCR扩增并进行T-A克隆和测序，在此基础上使用RepeatMasker、DNAMAN4.0、BioEdit4.8.10、Clustal W1.81等生物信息学软件进行序列分析。【结果】牦牛H-FABP基因(已在NCBI上登录，登录号为DQ026674)由4个外显子和3个内含子组成，CDS序列全长为402 bp，前体氨基酸数为133个。4个外显子大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp；3个内含子大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp；外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。外显子和内含子个数与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种相同。牦牛H-FABP基因序列中，重复序列所占比率为13.07%。内含子Ⅰ含有5个重复元件，包括1个SINE/Artiodactyls元件、1个SINE/MIR3元件、1个SINE/Bov-tA1元件和2个SINE/MIR元件；内含子Ⅱ无重复元件；内含子Ⅲ有3个重复元件，其中SINE/MIR元件、LINE/L2元件、SINE/Artiodactyls元件各1个。SINEs短重复序列所占比率为11.85%，哺乳动物分散性重复序列MIRs比率为6.44%。LINEs所占比率为1.22%，小于SINEs元件。其中，LINE1、BovB/Art2、L3/CR1重复元件以及LTR类反转录元件和DNA转座子元件在牦牛该基因区域中不存在。不同物种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的保守性。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种在H-FABP基因编码区核苷酸序列上同源性大小分别为99.8%、97.8%、97.0%、92.8%、88.8%、83.3%、83.1%、76.4%、68.7%；相应的氨基酸序列间同源性大小为100%、96.9%、96.9%、92.4%、88.7%、85.7%、85.7%、77.4%、69.9%。【结论】牦牛H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，其中外显子I、外显子Ⅱ、 外显子Ⅲ 和外显子Ⅳ大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp，内含子I、内含子Ⅱ和内含子Ⅲ大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp。牦牛该基因区域含有较为丰富的重复序列元件且外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼9个物种在H-FABP基因编码区核苷酸及氨基酸序列上具有较高的保守性。     

绵羊生长激素基因第4外显子的多态性分析

采用PCR-SSCP技术检测包括蒙古羊、小尾寒羊、德国美利奴羊以及德美寒杂交一代在内的绵羊生长激素(GH)基因第4外显子的多态性.结果表明:在1188~1502 bp片段上,德国美利奴羊及杂交后代中,AA型个体占多数,而小尾寒羊则以BB型个体为主.对这个片段的纯合型(AA,BB)分别进行克隆测序发现:1188~1502 bp片段上,AA型在第1406位发生了T→C的突变.实验结果证实绵羊生长激素基因第4外显子存在序列多态性.     

甘南藏羊GH基因第4外显子多态性与肉用性能的相关性分析

为探索GH基因与绵羊肉用性能的相关性,利用PCR-SSCP方法,对甘肃甘南‘欧拉型’、‘甘加型’和‘乔科型’藏羊(共154只)GH基因第4外显子进行了多态性检测,并从其中随机选择62只(‘欧拉羊’22只、‘甘加羊’22只、‘乔科羊’18只)进行肉品质测定及相关性分析.结果表明:甘南藏羊GH基因在第4外显子存在AA和AB 2种基因型,AB型个体在1 286bp处存在T/C的杂合;检测到的多态位点与肉用性能相关性分析表明,‘欧拉羊’的AA型个体的屠宰率和剪切力显著高于AB型个体(P<0.05),但AB型个体的背最长肌在宰后24h时的pH值显著大于AA型(P<0.05),‘甘加羊’与‘乔科羊’不同基因型各指标间均差异不显著(P>0.05).     

小麦类受体蛋白基因TaRLP19 cDNA序列克隆及分析

为筛选小麦叶锈病抗病相关基因,以从小麦近等基因系TcLr19中获得的特异表达的168 bp cDNA-AFLP片段为靶序列,通过cDNA末端快速扩增(RACE)的方法获得2545 bp的cDNA序列,并在接菌的TcLr19叶片中进行RT-PCR验证,测序结果与RACE结果一致.tBLASTn比对发现该序列与预测的二穗短柄草的Receptor-like protein 2-like (LOC100825532)有67％的一致性(Expect=0.0).该基因包含一个2136 bp的开放阅读框,编码711个氨基酸;SMART分析表明其含有6个LRR结构域,属LRR-TM类型,推测其为假定的富含亮氨酸的类受体蛋白基因,暂命名为TaRLP19,GenBank登录号为(JN872563).半定量RT-PCR分析表明,该基因属组成型特异表达类型.为进一步研究叶锈菌与小麦TcLr19非亲和反应中类受体蛋白TaRLP19的功能及其表达调控机制等奠定基础.     

济宁青山羊MTNR1A基因外显子2的克隆与序列分析

对常年发情的山羊品种济宁青山羊和季节性发情的山羊品种辽宁绒山羊共20只母羊的褪黑激素受体1A(melatonin receptor 1A,MTNR1A)基因外显子2的824 bp扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析.结果表明,济宁青山羊MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列与已发表的山羊序列(GenBank登录号AF419334)完全相同.济宁青山羊与辽宁绒山羊MTNR1A基因外显子2的差异由11个核苷酸变化(A52G、T232C、T253C、A256G、T358G、T410A、A414T、C424T、A554G、T559C和C589A)组成,核苷酸同源性为98.7%.济宁青山羊与绵羊、母牛、猪、人、小鼠、挪威大鼠、西伯利亚仓鼠、鸡之间MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列同源性为73.5%～98.4%,氨基酸序列同源性为79.2%～98.5%.     

鹅LPL基因外显子4、5、6克隆及序列分析

为揭示鹅脂蛋白脂酶(LPL)脂质和肝素结合区域的特性,对鹅LPL基因外显子4~6进行了克隆和序列分析。以皖西白鹅血清总DNA为模板,设计引物对鹅LPL基因的第4~6外显子区域进行扩增和测序,分析鹅与其他物种之间该区域的DNA序列同源性、密码子非随机应用以及相应氨基酸残基区域的亲水性。结果表明,鹅LPL基因外显子4~6的片段大小分别为112、234和243 bp,其序列与鸡LPL基因相应序列的同源性达到91.9%,与人、羊、牛、猪等哺乳动物的同源性为74%~77%;鹅与鸡密码子非随机应用的相似系数为0.839,与猪和鼠的相似系数为0.580~0.650;LPL中由外显子4~6编码的氨基酸残基有4个区域具有较大的表面概率,分别位于残基145~148、残基187~190、残基255~257和残基293~299区域,表面概率分别1.62~4.29、2.06~3.01、2.75~4.46和3.03~6.01,这些区域伴随有较强的亲水性。     

金定鸭FSHR基因第1～7外显子的克隆及SNP位点的筛查

动物的繁殖活动主要受内分泌生殖激素的调控,FSHR存在于卵泡颗粒细胞膜上,属于G蛋白偶联受体家族,对动物卵巢细胞的发育、成熟和排卵具有重要的作用。本研究以高产和低产金定鸭基因组为模板,通过PCR扩增、目的基因片段克隆和测序等方法,获取金定鸭FSHR基因1~7外显子序列,并对基因序列进行比对分析。结果显示,序列a包含第1外显子(185bp)的完整序列,第1内含子(145bp)的部分序列;序列b包含第2(75bp)、3外显子(75bp)、第2内含子(463bp)的完整序列,第1(40bp)、3内含子(47bp)的部分序列;序列c包含第4外显子(75bp)的完整序列,第3(180bp)、4内含子(55bp)的部分序列;序列d包含第5外显子(78bp)的完整序列,第4(232bp)、5内含子(56bp)的部分序列;序列e包含第6(69bp)、7外显子(75bp)、第6内含子(117bp)的完整序列,第5(133bp)、7内含子(146bp)的部分序列。根据基因序列特征,对获取的5段金定鸭FSHR基因序列进行扩增序列测序比对。结果发现:在外显子1第50bp处存在A/G突变;在外显子2第30bp处存在A/G突变;在外显子4第33bp处存在C/T突变;在外显子5第45bp处存在A/G突变,第19bp处可能存在A/T突变,33bp处可能存在C/T突变。金定鸭FSHR基因序列的克隆及SNP突变位点的发现可为后续开展FSHR基因的多态性与金定鸭产蛋性能的相关研究奠定一定的基础。     

北京荷斯坦母牛BoLA-DRB3基因外显子2的克隆与序列分析

采用PCR技术扩增出北京荷斯坦母牛BoLA-DRB3基因的外显子2的267 bp大小的片段,将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中,重组质粒用PCR和酶切分析进行阳性克隆鉴定,然后测定核苷酸序列,并推导其氨基酸序列.北京荷斯坦牛、蒙古牛、人类、瑞典红白花牛、蒙古绵羊、西班牙山羊之间DRB3基因外显子2的核苷酸序列同源性为80.9%～95.5%,氨基酸序列同源性为75.3%～91.0%.