大鼠肝细胞分离和原代培养的简易方法

体外分离培养肝细胞是人工肝、毒理学、药理学、生理学以及基因工程等研究的基础,良好的分离技术是获取高活性肝细胞的前提.     

大鼠原代肝细胞培养方法的建立

体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多,但均存在一些缺陷。对胶原酶灌流法进行改良,采用细胞密度为6×105个/mL,细胞生长状态好,既能保证细胞活率,又能满足下一步试验要求。用胰酶代替胶原酶进行肝脏灌注,胰酶最适浓度为0.18%,且灌流时维持最适温度37℃,分离得到的肝细胞存活率大于90%,且纯度很高,是一种操作简便、细胞存活率和纯度较高的新的大鼠原代肝细胞体外培养方法。     

速眠新对大鼠原代肝细胞CYP3A1、CYP2E1的影响

胶原酶二步灌流法获取原代大鼠肝细胞,用不同浓度的速眠新和保定宁处理,Western blot法测定肝细胞中细胞色素酶P450 3A1(CYP3A1)和细胞色素酶P4502E1(CYP 2E1)的表达水平.结果表明:通过胶原酶灌流法,每只大鼠可获得2～4×108个肝细胞,成活率约为95%.用速眠新、保定宁处理后,肝细胞CYP3A1和CYP2E1的表达随速眠新、保定宁浓度的增加和处理时间的延长而呈升高的趋势.原代大鼠肝细胞可用于速眠新药物代谢分子机制的研究,为其临床上合理地应用提供了理论依据.     

鲤鱼肝细胞的原代培养研究

[目的]探讨鲤鱼肝细胞原代培养的最佳条件。[方法]通过对鲤鱼的肝脏细胞进行原代培养,分析不同培养基、温度、pH、胰蛋白酶浓度、生长时间对鲤鱼肝细胞生长状况的影响,并测定肝细胞活力。[结果]鲤鱼肝细胞培养的最佳条件为:温度在25℃左右,pH7.4,胰蛋白酶浓度0.250%,消化时间40 min,培养基为M199。分离肝细胞的平均存活率>85%,每克肝平均可获得3.8×106个分离细胞,在细胞活力及数量上达到最佳平衡。[结论]该研究可为建立稳定的毒理学和药理学试验模型奠定基础。     

镉对大鼠原代培养肝细胞毒性的研究

为探讨镉对原代大鼠肝细胞的毒性作用。用二步灌流法获得大鼠肝细胞,肝细胞暴露于浓度为2.5、5.0、10.0、20.0μmoL/L的醋酸镉中12、24 h,应用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法检测醋酸镉对肝细胞存活率的影响及培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性变化。结果表明,肝细胞暴露于浓度为2.5、5.0、10.0、20.0μmoL/L的醋酸镉中,细胞相对存活率显著下降(P0.01),LDH的释放量增加,且具有剂量效应关系。提示一定浓度的醋酸镉可引起肝细胞的毒性损伤。     

大口黑鲈肝细胞原代培养方法的建立

取材大口黑鲈肝脏组织,培养其原代细胞,比较研究了组织块法和酶消化法两种培养方法及不同的培养条件,以确定其最佳培养方法和条件,同时观察了长期培养过程中肝细胞的形态变化。结果表明:组织块方法不适于大口黑鲈肝细胞的培养,未见细胞从组织块中迁出。而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的培养效果。胰蛋白酶浓度0.25%,消化时间20 min,分步收集肝细胞,经台盼蓝检测和血球计数板计数,平均活力>90%,每克肝重可获得3×106个分离肝细胞。在细胞活力和数量两方面达到最佳平衡。在含20%胎牛血清、10μg/mL胰岛素的M199/L15培养基中,于4%CO2,28℃培养箱中长期培养并传代。     

大口黑鲈肝细胞原代培养方法的建立

取材大口黑鲈肝脏组织,培养其原代细胞,比较研究了组织块法和酶消化法两种培养方法及不同的培养条件,以确定其最佳培养方法和条件,同时观察了长期培养过程中肝细胞的形态变化。结果表明:组织块方法不适于大口黑鲈肝细胞的培养,未见细胞从组织块中迁出。而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的培养效果。胰蛋白酶浓度0.25%,消化时间20 min,分步收集肝细胞,经台盼蓝检测和血球计数板计数,平均活力>90%,每克肝重可获得3×106个分离肝细胞。在细胞活力和数量两方面达到最佳平衡。在含20%胎牛血清、10μg/mL胰岛素的M199/L15培养基中,于4%CO2,28℃培养箱中长期培养并传代。     

大鼠原代肝细胞培养方法的建立

体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多,但均存在一些缺陷。对胶原酶灌流法进行改良,采用细胞密度为6×105个/mL,细胞生长状态好,既能保证细胞活率,又能满足下一步试验要求。用胰酶代替胶原酶进行肝脏灌注,胰酶最适浓度为0.18%,且灌流时维持最适温度37℃,分离得到的肝细胞存活率大于90%,且纯度很高,是一种操作简便、细胞存活率和纯度较高的新的大鼠原代肝细胞体外培养方法。     

成年鸡肝细胞的分离与原代培养

以8~10周龄的雄性黄羽鸡为对象,比较了原位两步胶原酶灌流法、改良的原位两步灌流法及原位一步灌流结合组织块消化法对成年鸡肝细胞的分离效果,同时比较了不同基础培养液对成年鸡肝细胞体外培养的影响。结果表明,采用改良的原位两步灌流法可以获得分离效果很好,均匀一致且活率达90%以上的肝细胞;以Williams’medium E为基础培养液,以1×105个/cm2密度接种,4 h后肝细胞贴壁,随后在含φ=7%新生牛血清的培养液中培养24 h后,肝上皮细胞呈现典型的多角形,核圆透亮,聚集呈岛屿状生长,48 h后增殖旺盛,96 h后基本铺满培养皿底部,出现胆小管样结构,并可维持存活13 d以上。本试验为进一步建立成年鸡肝细胞无血清培养体系,体外研究其功能奠定了基础。     

异硫氰酸丙烯酯对大鼠肝细胞凋亡的影响

为研究异硫氰酸丙烯酯对细胞活性的影响,试验以20mg·L-1的内毒素(LPS)和1.25×10-5mol·L-1的异硫氰酸丙稀酯(AITC)分别或共同处理大鼠肝细胞3h后,用AnnexinV/PI双染色,流式细胞术分析细胞凋亡;反转录酶聚合酶链反应(RT-RCR)分析FasL和Caspase-8的表达情况。结果表明,AITC能有效抑制LPS(20mg·L-1)诱导的肝细胞凋亡,且在此过程中,FasL、Caspase-8的表达量均有减少。结果提示AITC可以通过Fas途径抑制LPS诱导的肝细胞凋亡,其作用有可能导致肿瘤的发生。     

不同剂量对乙酰氨基酚诱导大鼠急性肝损伤的研究

通过测定SD大鼠血浆及肝组织中六种酶的活性或含量,探索对乙酰氨基酚短期内对大鼠肝脏的损伤作用。SD大鼠实验组分别皮下注射75、150、250 mg·kg-1剂量的对乙酰氨基酚,对照组注射生理盐水且于给药后1、6、24 h分别采取血浆和肝组织,采用比色法检测各项指标。结果显示:高剂量组大鼠血浆中AST(356.72±43.87 U·L-1)和ALT(325±40.56 U·L-1)以及肝匀浆中GSH(4.55±0.53 mmol·prot-1)、SOD(90.1±12.23 U·g-1)和MDA(230.24±40.43 nmol·g-1)与对照组相比,差异极显著(P0.01),说明250 mg·kg-1剂量的对乙酰氨基酚可对大鼠肝脏产生急性损伤作用。     

氧化应激在镉致大鼠肝细胞凋亡中的作用

 【目的】探讨氧化应激在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的作用。【方法】采用两步灌流法获得大鼠肝细胞,经过24 h培养,用醋酸镉处理细胞,或者Z-VAD-fmk、NAC和镉共同处理细胞。应用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞内ROS水平和线粒体膜电位,分光光度法检测caspase-3活性、GSH和MDA含量。【结果】结果表明,肝细胞暴露于浓度为2.5、5、10 μmol•L-1的镉后,细胞相对存活率显著下降（P＜0.01）,凋亡率显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01）,呈剂量-效应关系;2.5和5 μmol•L-1镉组在1.5 h之前导致细胞内ROS水平显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01）;镉暴露可使肝细胞Δψm显著或极显著降低（P＜0.05或P＜0.01）;NAC能够显著减少镉引起的凋亡细胞数量和极显著降低凋亡率（P＜0.01）,可以显著降低单独镉暴露组ROS水平升高和阻止ΔΨm降低（P＜0.05）;细胞内GSH含量12 h时随镉剂量增高而降低,部分剂量组极显著低于对照组（P＜0.01）,24 h时随剂量增高而升高,部分剂量组显著或极显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01）;细胞内MDA含量随着镉浓度的增大而升高,10 μmol•L-1剂量组MDA的含量显著高于对照组（P＜0.05）;未见caspase-3活性升高,caspase抑制剂Z-VAD-fmk对镉致细胞凋亡无影响。【结论】醋酸镉致肝细胞凋亡与其引起ROS产生并导致氧化损伤的非caspase途径有关。     

鱼类肝细胞分离、原代培养与应用研究综述

鱼类肝细胞分离与原代培养技术已有30多年的历史,目前已有40多种鱼的肝细胞被分离、培养并用于各种研究中。主要讨论鱼类肝细胞的分离与培养方法以及不同条件对细胞生理的影响;概括鱼类肝细胞体外培养在生理学、环境毒理学和药理学等方面的应用研究,旨在为建立更多的鱼类肝细胞原代培养模型并应用于相关的研究领域提供参考依据。     

鹅SCD1基因真核表达载体构建及在肝细胞中的表达

构建硬酯酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA Desaturase l,SCD1)真核表达质粒pcDNA3.1(+)/SCD1,转染鹅原代肝细胞验证其对细胞中脂肪代谢的影响。根据鹅SCD1基因设计带有酶切位点引物,RT-PCR扩增SCD1基因,克隆至pMD-19T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,构建重组真核表达载体pCDNA3.1(+)/SCD1。酶切及序列测定测序正确后转染鹅原代培养肝细胞,荧光定量PCR检测SCD1基因的表达,并用油红O染色检测细胞中脂滴情况。结果:成功构建SCD1基因真核表达载体,转染鹅原代培养肝细胞后SCD1基因获得了表达,与脂肪代谢相关基因SREBP表达上调,同时检测到细胞中脂滴明显增多。结论:构建了重组质粒pCDNA3.1(+)/SCD1,并在鹅原代培养细胞中获得表达,为进一步研究SCD1基因在鹅肝脏脂肪代谢中的作用奠定基础。     

浮萍放养体系对污水氮磷的净化效果

以经筛选得到的本地优势浮萍和水花生为供试材料，以生活污水和经稀释的牛场厌氧废水为供试污水，在实验室条件下考察了浮萍单种体系和浮萍-水花生混养体系对污水氮、磷的净化效果。结果表明，浮萍单种体系、浮萍-水花生混养体系对供试污水TN、TP的最大去除率分别为95．24％、91．13％和86．42％、86．43％。在低有机污染条件下，浮萍单种体系对污水氮、磷的净化效果优于浮萍-水花生混养体系；当水体有机污染程度较高时，浮萍单种体系对氮、磷的去除率明显下降，而混养体系依然能对污水氮、磷进行高效去除。     

曼陀罗杀鼠活性研究初报

曼陀罗杀鼠活性研究表明,在饵料中曼陀罗含量为20时,曼陀罗种子、茎对小白鼠的毒杀率均为100,叶为88.9,果壳为80;在含量为15时,毒杀率分别为90、70、50和80;在含量为10时,毒杀率分别为70、66.7、0和20;以家鸡进行安全性试验,无二次中毒现象.     

苦参素对D-氨基半乳糖苷诱导的肝细胞凋亡的干预研究

[目的]研究氧化苦参碱对肝细胞凋亡的影响。[方法]采用D-氨基半乳糖苷(D-GalN)诱导人源HL-7702肝细胞发生凋亡,探索最佳的凋亡诱导参数,建立肝细胞凋亡模型,并运用建立的体外肝细胞凋亡模型,探讨氧化苦参碱的抗凋亡作用。[结果]D-GalN在60mmol/L浓度下与HL-7702肝细胞孵育8 h为最优建模条件,在此处理条件下经凝胶电泳可见细胞凋亡特征性的DNA ladder;且与对照组相比,HL-7702细胞处理后其ALT、AST、SOD、MDA、Caspases-3水平均显著升高(P0.05)。[结论]D-GalN诱导的HL-7702肝细胞凋亡的发生机制可能与线粒体信号转导途径有关,而氧化苦参碱对D-GalN引起的肝细胞凋亡具有较强的干预作用,其抗凋亡机制可能与抑制Caspases-3、CytC、TNFα和TGF-β1等凋亡因子和诱导抗凋亡因子HO-1表达有关。