猪圆环病毒Ⅱ型ORF2部分基因的克隆及原核表达

根据发表的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)ORF2基因序列,设计合成1对特异性引物,从分离到的PCV2吉林株(JL01)中扩增出PCV2 ORF2579 bp的核苷酸片段,克隆到表达载体pET-32a中,经BamHⅠ和HindⅢ酶切及序列分析获得阳性重组表达质粒pET-32a-ORF2。将其转化到表达宿主菌BL21中,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的部分结构蛋白,分子量为40 kD。通过SDS-PAGE和Western检测表明,表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的反应原性。     

2型猪圆环病毒ORF2基因的原核表达

本研究克隆、原核表达了猪圆环病毒2型Cap蛋白。根据新分离毒株PCV2-871的已知序列设计一对引物,PCR扩增其去掉核定位信号的ORF2基因,命名为pcv-581,利用引入的双酶切位点BamHI/HindⅢ将其连接到表达载体pQE-32中,命名为pQE-pcv581转化大肠杆菌M15中,经IPTG诱导表达和SDS-PAGE鉴定,发现去核定位信号的ORF2片段可以大量表达。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达

为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的克隆及原核表达

以细胞总基因组提取试剂盒抽提PCV2细胞毒株总DNA为模板,用特异性引物扩增PCV2 ORF3基因。将ORF3和表达载体pGEX-6p-1用BamH I和Sal I双酶切回收后连接,将测序验证为阳性的重组质粒命名为pGEX-6p-1-ORF3。重组质粒pGEX-6p-1-ORF3转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达并纯化,对获得的表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测。结果表明:PCV2 ORF3在pGEX-6p-1中获得了高效表达,其表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约为37 kD,且能够和PCV2阳性血清发生特异性相互作用,具有免疫学活性。     

猪圆环病毒Ⅱ型河南地方株 ORF3的克隆及原核表达

为获得猪圆环病毒Ⅱ型 ORF3编码蛋白,研究该蛋白的特性及功能,根据 GenBank 数据库中PCVⅡ的基因组序列设计引物,利用 PCR 从病料基因组 DNA 中扩增 PCVⅡ河南地方株 ORF3,将其克隆至表达载体 pET 32a 中进行诱导表达,SDS PAGE 电泳检测重组蛋白表达情况,采用 Ni＋NTA 亲和纯化表达产物,透析复性后免疫日本大白兔制备多抗血清,并采用 ELISA 和 Western blot方法检测多抗血清的效价和特异性。结果显示,PCR 扩增获得全长315 bp 的 ORF3,重组质粒经测序和双酶切证实构建正确;SDS PAGE 结果显示,ORF3能够在大肠杆菌中表达,产物的分子量约为30 ku,以包涵体形式存在;纯化的重组蛋白具有较好的抗原性,制备的多抗血清抗体效价达1∶12800以上,抗体特异性高,能与表达的 ORF3编码蛋白结合。成功克隆了 PCVⅡ河南地方株 ORF3并实现原核表达,获得纯化的重组 ORF3编码蛋白。     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4~0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4⁰.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的]建立一种检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[方法]从已构建的克隆质粒pMD-ORF2上酶切回收ORF2基因的羧基端部分ORFc片段,克隆到pGEX-6P-1表达载体上,构建原核表达质粒pGEX-ORFc,转化入大肠杆菌BL21进行原核表达,用Western-blot法检测纯化蛋白,将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,从而建立检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[结果]重组表达质粒的酶切鉴定证明已成功构建重组表达质粒pGEX-ORFc,其在E.coliBL21中诱导5、6 h时表达效果最好。纯化后的蛋白条带与原重组菌位置一致均在40.0 kD处,证明重组蛋白得到良好纯化。试验确定抗原最佳包被浓度为12.85μg/m l,血清稀释度为1∶40。3次重复检测表明,变异系数最大为7.12%。[结论]建立的ELISA方法对检测PCV2感染具有良好的特异性及重复性。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

猪圆环病毒是引起猪多系统衰竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列,并将扩增片段定向插入质粒载体pPRO-HTb,转化BL21大肠杆菌后,构建了表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组原核表达系统。经IPTG诱导,对表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物以包涵体形式存在于菌体中,通过提取包涵体,获得了初步纯化的ORF2蛋白,为进一步利用PCV2ORF2蛋白抗原进行PCV血清学检测提供了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

猪圆环病毒是引起猪多系统哀竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列,并将扩增片段定向插入质粒载体pPRO—HTb,转化BE21大肠杆菌后,构建了表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组原核表达系统。经IPTG诱导,对表达产物经SDS—PAGE和Western—blot分析,表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物以包涵体形式存在于菌体中,通过提取包涵体,获得了初步纯化的ORF2蛋白,为进一步利用PCV2 ORF2蛋白抗原进行PCV血清学检测提供了基础。     

猪圆环病毒2型ORF4基因的原核表达及多克隆抗体的制备

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原,ORF4是PCV2中继ORF1,ORF2,ORF3之后的第四大开放阅读框。本研究以提取的PCV2基因组为模板经PCR扩增获得ORF4基因（386~565 nt）,并克隆到pGEX\|4T\|1表达载体上,构建pGEX\|4T\|ORF4表达载体。经PCR和测序鉴定后,将重组质粒转化受体菌BL21诱导表达并进行目的蛋白GST\|ORF4纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰兔,在免疫期间采血并用间接ELISA对多抗血清进行效价测定。SDS\|PAGE电泳检测结果表明,重组质粒成功表达了目的蛋白。ELISA检测结果显示抗体效价达到1∶12 800以上。Western blot分析表明ORF4融合蛋白具有很好的免疫原性,获得的抗体可以和大肠杆菌表达的GST\|ORF4融合蛋白特异性反应。     

猪圆环病毒2型ORF1和ORF3 T淋巴细胞抗原表位的克隆与原核表达

根据Stevenson筛选出来的3个具有活性的T淋巴细胞抗原表位(T lymphocyte epitope,TCE)合成tce基因(180 bp),成功插入到pMD18-T Simple载体中,筛选获得重组质粒,命名为pMD-TCE.将tce酶切产物亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒,命名为pET-TCE.用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示合成基因在pET-32a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白相对分子质量约为25 000,Western-blot分析结果表明,获得的融合蛋白可与猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性.     

猪圆环病毒Ⅱ型新疆分离株全基因组及ORF2基因的克隆与测序

根据GenBank中已发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对特异性引物。将PCV2新疆分离株(PCV2-XJ)用PK15细胞培养数代,从细胞培养物中提取病毒总DNA,并取其作为模板,PCR扩增出病毒全基因和结构基因(ORF2)。将PCR回收产物克隆到pMD18-T载体,成功构建了重组质粒pMD18-TPCV2和pMD18-T-ORF2,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用序列分析软件对测序结果分析可知,克隆得到的PCV2-XJ基因组全长1 768 bp。通过序列分析结果显示,PCV2-XJ与国内外PCV1、PCV2参考毒株的核苷酸同源性分别为99.5%～99.7%和68.7%;与HuB08(FJ041151)参考株核苷酸同源性最高(99.7%)。PCV2-XJ株ORF2基因与参考株核苷酸和氨基酸同源性分别高达99.3%和98.8%。     

猪圆环病毒2型ORF5编码非结构蛋白的表达

【目的】探讨猪圆环病毒2型(PCV-2)中ORF5所编码非结构蛋白(NS)的功能。【方法】根据Gen-Bank已发表PCV-2基因组序列设计特异引物,分别以HZ0201株(AY188355)、美国98-15237株病毒DNA为模板,采用PCR法扩增PCV-2ORF5基因,并构建了pGEX-4T-1-ORF5原核表达载体和pEGFP-C2-ORF5真核表达载体,对ORF5重组蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western blot分析,用真核表达载体pEGFP-C2-ORF5转染PCV-2易感细胞PK-15。【结果】PCV-2ORF5基因长162bp,编码54个氨基酸;其所编码蛋白在E.coli中以包涵体形式存在,分子质量大小约为32ku。【结论】PCV-2ORF5编码重组蛋白在真核PK-15细胞中成功表达。     

猪2型圆环病毒ORF2基因片段的克隆与序列分析

利用ArrayDesigner2.0软件设计PCV2引物直接从PDNS病料肺组织中PCR扩增获得PCVCQB7基因片段,用pMD18-T载体连接、克隆获得PCVCQB7重组质粒。序列测定和与标准毒株对位比对分析PCVCQB7核苷酸序列全长624bp,系PCV2ORF2基因片段,与PCV2分离株的核苷酸序列相似性在80%以上,与PCV1在66%以下,采用最大似然法构建的系统发生树分析发现PCVCQB7位于PCV2主枝上,并与国内和欧洲分离株Imp.1147、304、375、QD、GD-TS、SH、24657_NL毒株亲缘关系较近形成一小分枝,表明PCVCQB7为引起PDNS的PCV2扩增产物。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白抗体诊断试剂IgG的研制

应用猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus 2,PCV2)ORF2重组蛋白,研制诊断PCV2的抗体试剂.利用原核表达系统表达PCV2 ORF2蛋白,经12%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳分析后免疫家兔制备抗PCV2 ORF2重组蛋白抗体,并用间接酶联免疫吸附试验(indirect-ELISA)确定其效价,然后以Western blotting法分析该抗体特异性.结果表明:PCV2 ORF2重组蛋白被表达,且在免疫家兔后获得效价高、特异性好的抗体.兔抗PCV2-ORF2重组蛋白抗体以其特异性好的特点可以作为免疫诊断试剂.     

猪圆环病毒2型陕西株Cap基因的原核表达

为了提高陕西地方性猪圆环的防治力,研究对一陕西地方猪圆环病毒2型毒株进行了Cap基因扩增,将扩增到的基因与p ET-32a构建表达载体,在BL21表达菌中进行原核表达,并应用western-blotting对其抗原性进行检测。结果显示,我们扩增到了大小为489 bp左右的基因片段,该基因与猪圆环病毒2型标准株Cap基因的最高核苷酸同源性约为93. 9%,氨基酸同源性约为84. 7%;其蛋白分子量约为18 ku,该蛋白能与猪圆环病毒2型阳性血清特异性结合,具有良好的抗原性。     

猪圆环病毒病Ⅱ型的防治

综述了猪圆环病毒病Ⅱ型的病原、流行病学、临床症状、病理变化,并提出了防制措施,以供养猪生产防治该病参考。     

猪圆环病毒Ⅱ型ZZ株ORF2基因的扩增、测序与序列分析

扩增PCV-2 ZZ毒株ORF2基因,并进行序列分析和同源比较。根据GenBank中PCV-2毒株基因序列设计1对特异性引物,对郑州分离株(ZZ)猪圆环病毒PCV-2型的ORF2基因进行了扩增。测序后,将所测序列与已公布的PCV-2 ORF2序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。通过扩增可获得702 bp的PCV-2 ORF2全基因,编码234个氨基酸,分子量27 995.93 D。所有毒株间的ORF2基因核苷酸同源性与氨基酸同源性均为89.2%~100%;ZZ株与HZ0201分离株的ORF2基因的核苷酸序列同源性较近(98.3%),而与hk102同源性较远(92.0%)。进化树分析表明,各分离毒株在进化上地理位置的相关性不明显。该研究对圆环病毒的流行病学和疫苗研究及其抗原的变异都具有重要参考价值。