猪Musclin基因片段克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析猪musclin基因;【方法】肌肉组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coliDH5α,检测阳性克隆并测序;【结果】克隆的猪musclin基因片段与人、大鼠、小鼠同源性分别为86%、78%、75%,预测的氨基酸序列含有“KKKR”结构和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域;【结论】克隆了猪musclin基因片段并注册GenBank(Ac-cession.EF369511)。     

猪脂肪特异性蛋白27基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,克隆并分析了猪脂肪特异性蛋白27基因.各种组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coli JM109,检测阳性克隆并测序.猪FSP27基因的cDNA序列,其全长为745bp,开放阅读框为11-72Top,编码有238个氨基酸.同源分析结果表明,猪FSP27的核酸序列与人、小鼠和牛的同源性分别为86%、77.6%、82.3%.氨基酸序列的同源性分别为83.2%、74.4%、79.3%.组织分布结果显示:猪FSP27基因在多种组织均有分布.克隆的猪FSP27基因并注册GenBank(Accession.EU395789).     

猪MBF1基因的克隆与序列分析

克隆了MBF1基因875 bp的c DNA序列和1 919 bp的基因全序列(登录号:EF 625885)。序列分析表明,猪MBF1基因序列与人、小鼠的相似性分别为89%和88%,氨基酸序列与人和小鼠的相似性分别为99%和97%,猪MBF1基因包含5个外显子和4个内含子,内含子的剪接方式都符合"GT-AG"法则;组织表达谱分析表明MBF1基因在心、肝、脾、肾、子宫中表达量较高,在胃和小肠中低表达。     

抗菌肽Protegrin-1基因的PCR扩增和克隆及序列分析

从杜长嘉猪的骨髓中提取基因组RNA,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增抗菌肽Protegrin-1(PPG-1)基因,获得一条565 bp的片断,以pGEM-T Easy vector为载体,将该基因片断克隆到大肠杆菌中.从筛选到的阳性克隆中分离出Protegrin-1基因,测定其序列,并由此推导出氨基酸序列.结果表明:①该片断长565 bp,为Protegrin-1基因cDNA的部分序列,序列同源性比较表明,该基因序列与GeneBank登录的Protegrin-1基因序列具有较高的同源性,达到98.8%.②根据所测序列推导其成熟肽由18个氨基酸残基组成,其氨基酸序列与GeneBank登录的Protegrin-1的成熟肽序列完全一致.     

猪胰岛素诱导1基因的cDNA克隆和差异表达及蛋白质序列分析

克隆猪胰岛素诱导1(INSIG1)基因,并对其蛋白质序列进行分析。根据人INSIG1基因的保守序列设计1对引物,以猪总RNA为模板,经RT–PCR获得INSIG1基因序列,通过相对荧光定量PCR分析该基因在不同组织中的表达量;将INSIG1基因序列连接到pMD19–T Simple载体上,用PCR检测阳性克隆后测序,并对克隆得到的基因进行生物信息学分析。结果表明,INSIG1基因在肺中的表达量最高,其次是在肝脏,再次是在脾脏,在心脏中的表达量最低;通过克隆,获得了一段999 bp的序列,其中831 bp的开放阅读框编码276个氨基酸;该蛋白不含信号肽序列,与其他动物INSIG1基因氨基酸序列的一致性在71%以上。     

牛MyoG基因启动子的克隆与序列分析

根据G enB ank中已公布的人、猪和小鼠的MyoG基因的5′侧翼和部分第一外显子序列设计PCR引物,用touch-dow n PCR技术扩增了牛MyoG基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGEM-T-MyoG,并通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定、测序及生物信息学分析。结果表明,牛MyoG基因的启动子序列(G en-bank中注册号为AY 882581)长度为672 bp,其与猪、人和小鼠相应序列的同源性分别为94%,91%和88%,且其在不同物种之间具有一定的保守性。牛MyoG基因启动子的克隆与序列分析为进一步研究牛MyoG基因的表达调控奠定了基础。     

猪IgGⅡB类Fc受体基因剪接异构体的克隆及序列分析

根据GenBank中猪IgGⅡB类Fc受体(swFcγ RⅡB)cDNA基因序列,利用Primer软件设计合成了1对特异性引物,应用RT-PCR技术,从猪外周血白细胞cDNA中扩增swFcγ RⅡB基因,将扩增的基因片段插入pTG19-T载体进行测序,利用DNAStar Protean软件对基因的氨基酸序列潜在抗原表位进行预测.结果表明,克隆的swFcγ RⅡB基因序列长度为951 bp,编码316个氨基酸,与已发表序列的核苷酸与氨基酸序列同源性分别为99 3%和98.3%,其胞内区多出19个氨基酸的插入,其氨基酸序列至少存在3个潜在优势抗原表位的区域.swFcγ RⅡB基因存在亚类,所克隆基因是swFcγ RⅡB基因的1种RNA剪接异构体,预示了swFcγ RⅡB基因至少存在2种RNA剪接异构体.     

绵羊intelectin基因cDNA克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊intelectin基因;【方法】十二指肠粘膜组织提取总RNA,分别以上游电子克隆的拼接体和下游保守区为模板设计引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E.coli JM109,筛选阳性克隆并测序;【结果】克隆的绵羊intelectin基因与牛、猪、人、大鼠的同源性分别为93%、87%、83%、79%,预测的氨基酸序列包含FBG结构域。【结论】成功克隆了绵羊intelectin-2基因,并注册GenBank(Accession.EF624459)。     

荣昌猪TYP基因克隆及其序列分析

实验根据人、牛的酪氨酸酶(TYR,tyrosinase)基因序列设计了3对引物,扩增出猪的酪氨酸酶基因外显子2,3,4序列,其长度分别为210,135,182 bp.对其进行了克隆测序,序列被GenBank收录,登录号分别为:AY 236997,AY279998,AY 242973.与人、牛、鼠的酪氨酸酶基因序列比对结果显示,TYR基因该区段在人、牛、鼠、猪上极其保守.     

IBV单链抗体的筛选及其互补决定区序列变异分析

【目的】筛选能表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)单链抗体(scFv)的原核阳性克隆,并分析scFv抗原结合位点的氨基酸变化。【方法】采用RT-PCR,从IBV疫苗免疫的鸡脾脏RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因。利用重组链延伸反应(SOE-PCR),将linker与VH和VL基因相连构建鸡scFv基因,并将其克隆到原核表达载体pOPE101-XP中,构建重组质粒并转入大肠杆菌表达,间接ELISA筛选原核表达的抗IBVscFv的阳性克隆,对其测序后进行Clustal.W多序列比较,分析scFv骨架区(FR)和互补决定区(CDR)氨基酸序列差异。【结果】筛选到表达IBVscFv的阳性克隆ZL.10和ZL.80;将它们的氨基酸序列与鸡胚系Gemline进行多序列比较,结果显示,ZL.10、ZL.80在CDR中易变异氨基酸占各区氨基酸的比率均在40%以上,其中VH的CDR3达90%,VL的CDR3达60%。此外,ZL.10、ZL.80在VH的CDR3区分别增加5个和7个氨基酸。FR氨基酸变异率较少,且大多均在12%以下,而FR4未发生突变。【结论】通过体外筛选原核表达产物的方法,获得了表达IBVscFv的阳性克隆ZL.10和ZL.80,其VH、VL氨基酸序列中的变异主要发生在各自的CDR,二者VH的CDR3氨基酸序列差异很大,提示这2个scFv阳性克隆针对的是IBV不同的抗原位点。     

新基因p7TP3剪切体1的克隆与亚细胞定位

利用RT-PCR技术扩增丙型肝炎病毒p7蛋白反式调节基因3剪切体1（p7TP3剪切体1）开放阅读框序列。将目的基因片段插入pGEM-T载体中,经双酶切和测序鉴定后,定向克隆至荧光表达载体pEGFP-C1,EcoRI及BamHI双酶切鉴定。脂质体法转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察确定其亚细胞定位。结果表明,p7TP3剪切体1片断长度为381 bp,与预期结果一致;亚细胞定位结果表明,该蛋白定位于细胞浆中。     

基于比较基因组学分析的方法定位及注释双峰驼MHC基因

【目的】定位并注释双峰驼主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因序列,为进一步研究双峰驼MHC基因提供科学依据。【方法】运用比较基因组学方法,提取人类MHC(HLA)基因编码序列和牛MHC(BoLA)基因编码序列并分别与双峰驼转录本进行blastn基因序列比对,识别出相似度较高的scaffolds,通过分析HLA、BoLA基因序列比对在这些scaffolds上的位置顺序,对多条scaffolds进行拼接,得到双峰驼MHC的Pseudo chromosome;再分别提取HLA、BoLA全基因组序列与双峰驼已拼接的scaffolds进行基因组共线性分析,利用lastz建立起的Pseudo chromosome与HLA、BoLA全基因组序列的线性关系判断筛选出的scaffolds是否准确;然后通过分析MHC基因在两物种间的线性关系,在双峰驼参考基因组中提取出MHC基因序列,并对这些序列进行基因注释;最后根据得到的双峰驼MHC基因绘制系统进化树,研究其基因间的进化关系。【结果】通过对HLA、BoLA基因编码序列与双峰驼转录本用blastn进行序列比对,识别出了相似度较高的3条scaffolds,即NW_011511766.1(全长4.1M)、NW_011515227.1(全长1.2M)和NW_011514613.1(全长15K),对其拼接得到双峰驼MHC的Pseudo chromosome;利用lastz共线性分析,识别出HLA基因序列和BoLA基因序列并比对出其在双峰驼MHC基因的共线性区域。该区域与拼接得到的Pseudo chromosome一致,证明筛选出的scaffolds是准确的。并且发现Class-Ⅰ类和Class-Ⅲ类基因集中分布在NW_011515227.1上,而Class-Ⅱ类基因集中分布在NW_011511766.1和NW_011514613.1上,进一步分析得知Class-Ⅱ类基因主要分布在NW_011511766.1的3.5—4.1M的位置;将存在共线性区域的序列提取出来,与比对到双峰驼上的MHC基因的编码序列进行blat分析,结果在双峰驼基因组中共识别出24个与牛BoLA基因高度相似的基因,其中Ⅰ类基因1个,Ⅱ类10个,Ⅲ类基因13个。对双峰驼这24个MHC基因进行信息注释并绘制系统进化树,结果显示注释的Class-Ⅰ类和Class-Ⅱ类基因在同一分支。【结论】通过比较基因组学方法定位并注释了双峰驼的MHC基因,将双峰驼MHC基因序列定位到了3条scaffolds上,找到并注释了24个MHC基因,绘制了双峰驼MHC的Pseudo chromosome,为进一步研究双峰驼MHC基因奠定了理论基础。     

鮰鱼SCYA107基因序列的比较分析

筛选BAC基因组文库得到阳性克隆后，利用引物步移法测定斑点叉尾鮰SCYA107基因组序列。该基因由四个外显子和三个内含子组成；外显子拼接的序列与cDNA序列完全一致，编码96个氨基酸，在N端含有两个相邻的半胱氨酸（CC）和两个不相邻的半胱氨酸，为典型的CC趋化因子亚家族成员；其上游调控序列有一些与免疫相关的转录因子结合位点；斑点叉尾鲴SCYA107氨基酸的结构和功能与小鼠趋化因子CCL20比较接近，而蓝叉尾鲴则更接近人CCL8，它们氨基酸序列的差别是由于斑点叉尾鲴SCYA107基因序列中多了ACAAA这5个核苷酸，导致读码框移位提前出现终止子TGA所造成的。     

鮰鱼SCYA107基因序列的比较分析

筛选BAC基因组文库得到阳性克隆后，利用引物步移法测定斑点叉尾鮰SCYA107基因组序列。该基因由四个外显子和三个内含子组成；外显子拼接的序列与cDNA序列完全一致，编码96个氨基酸，在N端含有两个相邻的半胱氨酸（CC）和两个不相邻的半胱氨酸，为典型的CC趋化因子亚家族成员；其上游调控序列有一些与免疫相关的转录因子结合位点；斑点叉尾鲴SCYA107氨基酸的结构和功能与小鼠趋化因子CCL20比较接近，而蓝叉尾鲴则更接近人CCL8，它们氨基酸序列的差别是由于斑点叉尾鲴SCYA107基因序列中多了ACAAA这5个核苷酸，导致读码框移位提前出现终止子TGA所造成的。     

Construction of Tobacco Bax lnhibitor-1 ihpRNA Gene Silencing Vector and Transformation into Agrobacterium tumefaciens EHA105

The plasmid pGSA1285 was first modified by substituting its GUS sequence with the Chalcone synthase intron fragment from vector pFGC5941 to get the plant silencing expression vector that contained Kanamycin resistance site and was named as pGSA2285. Using PCR-based amplification, two different restriction sites at both ends of tobacco Bax inhibitor-1 (NtBI-1) gene were created, respectively, which made the construction of ihpRNA gene silencing vector more efficiently. Then, NtBI-1 genes were inserted into Multiple Cloning Site (MCS) of pGSA2285 respectively to form Bax inhibitor-1 ihpRNA gene silencing vector, named as pGSA4285, containing sense and anti-sense BI-1 sequence which was spliced by chalcone synthase intron. Combined PCR identification and enzyme restriction analyses, the results showed that Bax inhibitor-1 ihpRNA gene silencing vector had been constructed and transferred into Agrobacterium tumefaciens EHA105 successfully, which laid a foundation for the further study on the function of BI-1 in plant PCD regulation.     

F4菌毛FaeG基因的克隆与序列分析

[目的]克隆F4菌毛FaeG基因,并对其进行序列分析。[方法]利用PCR方法从6株标准F4菌株中扩增FaeG基因片段,测序后用DNAStar软件进行分析和拼接,并与已发表的F4菌毛基因序列进行分析和比较,绘制基因进化树,比较它们之间的同源性和进化关系。[结果]试验成功扩增出FaeG基因片段;所扩增的6株已知血清变异型F4大肠杆菌与标准F4菌株同属于各自基因型,且F4ab与F4ac间的进化关系比与F4ad菌株间的近。[结论]通过该研究可推测F4菌株3个血清变异型的检测不仅可用单因子血清,而且可从DNA水平上进行检测。     

内含子的识别和选择性剪切

真核生物内含子的一个显著特征是在很多生物中其5'和3'剪切位点的基本序列都具有相对很高的保守性,内含子从mRNA前体转录产物中的去除和伴随的外显子的连接称作mRNA前体的剪切,它是构成真核基因表达和基因调控水平的一个重要方面。这个过程由许多具有有限序列和特殊空间结构的顺式作用元件控制,由被称为剪切体的核糖核蛋白复合体来执行。以内含子的识别和由于识别造成的选择性剪切进行了综述,试图去理解造成选择性剪切的分子机理。     

3种微生物诱导的家蚕attacin基因异常表达形式的研究(英文)

[Objective] The aim of this research was to study the expression of silkworm attacin gene induced by some different microorganisms.[Method] Three kinds of microorganism,BmNPV,JM109 and Agrobacterium LBA4404,were ingested to silkworm and the expression profile of attacin gene in hemocyte and fat body was detected by semi-quantitative PCR.And subsequently,the PCR products were cloned and sequenced for further analysis.[Result] A specific band,about 800 bp,appeared in fat body of all induced silkworms.As indicated by the results of cloning and sequencing(GenBank accession number:FJ373019),the band was produced because the 2 introns existing in normal expression form were not spliced.Furthermore,when the extended expression sequence was translated into amino acids,the translation stopped earlier by the stop codon TGA at the 5’ end of the first intron of the original sequence,leading the loss of attacin C terminus.[Conclusion] There were two splicesomes of attacin gene,which had reference value to study the role of the attacin gene in silkworm immunity.     

"大通牦牛"Lfcin基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆“大通牦牛”Lfcin基因,为将该基因应用于饲料工业和养殖业提供依据。[方法]利用PCR技术从“大通牦牛”基因组DNA中获得乳铁蛋白素（Lactoferricin,Lfcin）基因序列;将Lfcin基因连接于pGEM-T easy载体,送至生物公司测序;将“大通牦牛”与奶牛的Lfcin基因序列进行比对;同时,对牦牛、奶牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白进行序列分析和进化树分析。[结果]克隆获得了含“大通牦牛”LF（Lactoferrin）第二外显子的DNA序列,共778bp,其中Lfcin基因编码区长75bp,编码25个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在11个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性;进化树分析表明Lfcin进化树符合物种进化规律。[结论]该研究为Lfcin基因在原核或真核细胞中的表达研究以及进一步研究Lfcin蛋白的生活活性奠定了基础。