甘露醇及AgNO3对根癌农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化的影响

多年生黑麦草是优良的牧草和草坪草.农杆菌介导多年生黑麦草遗传转化非常困难.为了建立稳定的多年生黑麦草遗传转化体系,本研究以品种"多福"种子成熟胚为外植体诱导愈伤组织,携质粒pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105介导,进行遗传转化.在预培养及共培养基中添加0.1 mol/L甘露醇或5 mg/L硝酸银,并分析了二者...     

农杆菌介导多年生黑麦草遗传转化体系的建立

AVP1基因能够提高植物的抗盐性,通过农杆菌介导AVP1基因转化多年生黑麦草,并建立了较为成熟的遗传转化体系。研究表明,将预培养4d的黑麦草胚性愈伤组织经OD600为0.6左右的农杆菌菌液在负压下侵染6min,共培养3d,用250mg/L的羧苄青霉素(Carb)脱菌,附加150μmol/L的乙酰丁香酮(AS),然后转接到含75mg/L潮霉素(Hpt)的筛选培养基上进行筛选培养的转化体系效果最佳。     

结缕草组织培养及农杆菌介导转化的主要因子优化

以破除休眠的结缕草种子为试材,对其愈伤组织的诱导、分化及农杆菌介导法转化的主要因子作了研究.结果表明,结缕草种子愈伤组织的诱导以含2,4-D 1 mg/L NAA 3 mg/L、分化以含6-BA 3 mg/L KT 3.5 mg/L、生根以含NAA 0.3 mg/L的MS培养基为佳.GUS瞬间表达研究表明,以继代培养2周的愈伤组织为起始材料,采用负压处理和农杆菌感染10 min,尔后在光条件下共培养转化为佳.     

紫花苜蓿基因转化的影响因素分析

通过农杆菌介导法对紫花苜蓿不同品种植株进行了抗旱基因转化的研究,得到了一套紫花苜蓿基因转化的优化体系。研究表明,100 mg/L的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长有着显著的抑制效应。250 mg/L头孢霉素能够有效地抑制农杆菌菌株LBA4404的生长。紫花苜蓿供试材料被切后直接用OD600值为0.3~0.5的农杆菌LBA4404菌液侵染10~15 min;培养材料共培养3 d后在愈伤组织诱导培养基MS 2 mg/L 2,4-D 0.5 mg/LKT 30 g/L蔗糖 9 g/L琼脂 250 mg/L Cef上诱导出愈伤组织;在体细胞胚分化培养基MS 1.0 mg/L BA 0.3 mg/L NAA 30 g/L蔗糖 9 g/L琼脂 50 mg/L Kan 250 mg/L Cef上促进体细胞胚的分化;分化出的体细胞胚在再生培养基上(同分化培养基,Kan为80 mg/L)进一步发育成抗性转化苗;转化的无根小苗在生根培养基1/2 MS 1.0 mg/L IBA 1%蔗糖 0.8%琼脂 100 mg/L卡那霉素上可生长出根系。     

2,4-D和6-BA对多年生黑麦草愈伤组织诱导影响的研究

以多年生黑麦草成熟种子作为外植体,MS为培养基,在不同的2,4-D和6-BA浓度下进行愈伤组织的诱导。实验表明:在2,4-D浓度为5mg/L,6-BA浓度为0.05mg/L时,多年生黑麦草各品种愈伤组织的质量和诱导率最高,在相同浓度的2,4-D或6-BA作用下,多年生黑麦草不同品种间愈伤组织诱导率存在显著差异。     

多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导PEPC基因的转化

以多年生黑麦草(Lolium perenne L.)成熟种子作为外植体,建立其高频再生体系,通过农杆菌介导法将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因转入,为多年生黑麦草的抗逆转基因工作奠定基础。结果表明:种子充分灭菌后在附加6.0 mg·L^-1 2,4-D的培养基中诱导愈伤组织,诱导率可达61.33%。愈伤组织在2,4-D浓度减半的培养基上继代培养长势良好,分化培养基为MS培养基附加1.0 mg·L^-16-BA,分化率最高达到61.33%,在1/2 MS+0.5 mg·L^-1 NAA培养基中进行生根培养,生根率达100%。以该再生体系为基础,将获得的愈伤组织作为外植体进行遗传转化,经筛选培养后得到再生植株,通过PCR及实时荧光定量(Real-Time)PCR验证表明PEPC基因已成功转入,转化率为8.67%。试验结果将为多年生黑麦草抗性品种的研究奠定基础。     

多年生黑麦草高频再生体系的建立及优化

从外植体预处理方式、基本培养基、激素浓度等方面着手,对多年生黑麦草愈伤组织诱导、继代、不定芽分化及再生过程中的影响因素进行了研究,提高了再生频率。结果如下：切取胚端半粒种子,经75%乙醇处理1min,0.1%HgCl处理15min,在经无菌水清洗4～6次后接种方式较好;愈伤组织诱导培养基以MS＋2,4—D 8.0 mg/L（或另添加甘露醇25 g/L）为佳;愈伤组织接种于MS＋2,4—D 8.0mg/L＋甘露醇25 g/L上进行1～2次继代后于NB＋6—BA2.0 mg/L上进行分化;不定芽转接至MS＋6—BA2.0 mg/L上进行扩繁或于1/2MS＋NAA0.5mg/L＋IAA0.5mg/L上进行生根。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因转基因玉米植株的构建及鉴定

为构建猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因转玉米植株,本研究以玉米自交系"丹598"和"H99"的胚性愈伤组织为材料,通过愈伤组织对卡那霉素的敏感性试验,确定了卡那霉素40mg/L～56mg/L为愈伤组织适宜选择压。利用农杆菌介导法将TGEV S基因导入玉米自交系中,并对农杆菌转化系统的条件进行了优化。结果表明,根癌农杆菌EHA105的菌液OD600nm值为0.5～0.6时,侵染20min为农杆菌转化的最适条件。并对转化的愈伤组织进行分化诱导出苗后进行PCR和Southern blot检测,证明外源目的基因已整合到玉米基因组中。     

多年生黑麦草愈伤组织遗传转化受体系统的建立

多年生黑麦草成熟胚为外植体,选择CC+2,4-D 4 mg/L为诱导培养基,NB+6-BA 2 mg/L为分化培养基,1/2 NB+IAA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L为生根培养基,建立了多年生黑麦草胚性愈伤组织高频诱导与再生系统,确定了G418(150~200 mg/L)、Hpt(50 mg/L)、Basta(20~30 mg/L)的筛选临界浓度,确定了最佳分化时间,探讨了建立多年生黑麦草转化受体系统的必要条件。     

紫花苜蓿体细胞胚高频再生体系的建立

以我国农艺性状优良的丰产紫花苜蓿Medicago sativa品种大叶苜蓿和甘肃省广为种植的优质紫花苜蓿品种陇东、陇中、甘农1号、甘农3号等的下胚轴、子叶、叶片和叶柄为外植体研究了不同培养基、激素配比以及脯氨酸、蔗糖和活性炭对紫花苜蓿胚性愈伤组织和体细胞胚诱导分化的影响,结果表明:最佳胚性愈伤诱导培养基为MS 2,4-D 5 mg/L KT 1 mg/L;最佳外植体为下胚轴。最佳体细胞胚诱导和分化培养基为SH;脯氨酸对体细胞胚的诱导分化无明显作用;在培养基中添加活性炭会降低体细胞胚诱导率;蔗糖浓度为20 g/L时体细胞胚诱导率最高。同时还建立了紫花苜蓿体细胞胚高频再生体系,为根癌农杆菌介导AtNHX1基因对紫花苜蓿的遗传转化打下了坚实的基础。     

AM真菌在白三叶-黑麦草体系中对抗逆信号的传导作用

白三叶-黑麦草混播草地是一种重要的栽培草地,丛枝菌根真菌(AMF)菌丝可以在地下形成菌丝桥,实现信号的传导。水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)及乙烯(ET)是重要的植物信号介导物质。在温室条件下,利用AM真菌菌丝桥连接白三叶和多年生黑麦草,并用针刺处理模拟蚜虫取食,通过测定SA、JA等相关指标,研究菌丝桥连接的植物间抗逆信号的传导途径,为利用AM真菌提高植物抗逆性提供理论依据。结果表明,菌丝桥连接分别提高黑麦草地上生物量和总生物量9.97%和10.68%(P<0.05),而未影响白三叶的总生物量;黑麦草植株过氧化物酶(POD)活性在针刺后12 h降低了43.01%(P<0.05),白三叶POD酶活性升高了104.09%(P>0.05)。同时,菌丝桥连接使黑麦草和白三叶的SA浓度在针刺后12 h分别降低了12.99%(P>0.05)和24.18%(P<0.05),JA浓度分别升高了44.69%和79.32%(P<0.05)。综上,1)在白三叶-黑麦草体系中,AM真菌可通过菌丝桥,连接白三叶和黑麦草,实现养分再分配,进而促进黑麦草地上部分生长;2)在菌丝桥连接的情况下,当白三叶和黑麦草同时受到胁迫时,二者对胁迫响应不同;3)菌丝桥能够使植物对逆境胁迫做出更加快速的反应;4)菌丝桥可以在白三叶和多年生黑麦草之间传导抗逆性信号,且这个过程主要由JA介导。     

过表达FaSAMDC基因提高黑麦草属植物的抗旱性和耐热性

主要探讨了在黑麦草属植物中导入高羊茅S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(FaSAMDC)对转基因植株抗旱耐热性的提高效果,为培育黑麦草抗旱耐热新品种提供种质新材料。选择黑麦草成熟种子为外植体,采用贵州省草业研究所分子生物学实验室构建的过表达载体以及黑麦草胚性愈伤组织高频植株再生和农杆菌介导的遗传转化体系,将克隆自高羊茅的FaSAMDC基因转入贵州地区主栽品种多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季的基因组内,经抗性筛选、PCR检测和Southern杂交分析验证,获得45株特高与44株四季的转基因植株,转化频率分别为2.93%和2.28%。抗旱耐热试验表明,在30 ℃高温和中度干旱胁迫条件下,特高转基因株系的根冠比比对照组培苗高出7.08%,叶片相对含水量(RWC)比对照高出13.12%,RWC降低幅度比对照少5.49个百分点;四季转基因株系的根冠比比对照组培苗高出6.54%,RWC比对照高出12.54%,RWC降低幅度比对照少6.50个百分点,差异均达到显著水平(P<0.05),证明转入FaSAMDC基因的黑麦草阳性株系的抗旱耐热能力得到了明显提高。形态与生长特征观测结果显示,与非转基因组培苗相比,转基因株系的叶长、株高、主茎节数减小,叶宽、单株分蘖数增加,叶色变深,植株形状趋向于叶片丛生的紧凑型,推测导入的FaSAMDC基因参与了基因表达、细胞分裂等生理功能的调节。     

Correlation of ergovaline and lolitrem B levels in endophyte-infected perennial ryegrass (Lolium perenne).

The varieties of perennial ryegrass (Lolium perenne) infected with the endophytic fungus Neotiphodium lolii contain several classes of toxic alkaloids, including ergopeptide alkaloids and lolitrem alkaloids. Lolitrem B, a potent tremorgen, is generally considered to be the predominant alkaloid in endophyte-infected perennial ryegrass. Ergovaline, a vasoconstrictor normally associated with endophyte-infected tall fescue (Festuca arudinacea), is also present in endophyte infected perennial ryegrass. Clinical signs of animals ingesting endophyte-infected perennial ryegrass are consistent with the presence of lolitrem B. However, clinical signs normally associated with ergovaline poisoning are not usually observed in animals ingesting endophyte-infected perennial ryegrass. A survey was conducted to quantitate both lolitrem B and ergovaline in 459 perennial ryegrass straw samples received at the Oregon State University College of Veterinary Medicine. Samples were analyzed for each alkaloid using separate high-performance liquid chromatography analyses. A strong positive correlation between the 2 alkaloids (r2 = 0.7335) was observed, especially in the samples containing <3,000 ppb (ng/g) lolitrem B. The threshold levels above which clinical signs typically occur are 2,000 ppb lolitrem B and 300-400 ppb ergovaline. All of the samples analyzed contained <425 ppb ergovaline.     

苇状羊茅EST-SSR标记在草甸羊茅和多年生黑麦草的通用分析

草甸羊茅（Festuca pratensis Huds）和多年生黑麦草（Lolium perenne Lam）均是禾本科、多年生草本植物,是优良的牧草和草坪草。本研究采用40对苇状羊茅（Festuca arundinacea Schred）的表达序列标签-简单序列重复（Expressed sequence tags-simple sequence repeats,EST-SSR）分子标记分别评比了18份草甸羊茅和18份多年生黑麦草的遗传的多样性,并发现上述标记在草甸羊茅和多年生黑麦草中的通用性比例分别为55%和50%。在草甸羊茅中22对引物共扩增出212个条带,每对引物扩增条带数在4～13之间,多态性条带总数为190条,百分率为89.62%;多年生黑麦草中20对引物共扩增出203个条带,条带数在4～16之间,多态性条带总数为182条,百分率为89.67％;另外,分子标记NFA103和NFA140可以直接用于区别多年生黑麦草和草甸羊茅。综上,本研究发掘的通用性引物对于两种草的遗传多样性分析及种质资源合理利用具有重要的意义。     

外源NO对渗透胁迫下多年生黑麦草幼苗生长和生理特性的影响

一氧化氮(Nitric oxide,NO)作为生物体广布的一种生理活性物质,可调节植物一系列生理生化反应,增强其对逆境的抵抗能力;为此,以15%PEG-6000模拟渗透胁迫,研究外源NO对多年生黑麦草(Lolium perenne L.)幼苗生长和生理特性的影响。结果表明:15%PEG-60000渗透胁迫下,0.1 mmol·L^-1NO供体硝普钠(Sodium nitroprus-side,SNP)可显著减轻对幼苗生长的抑制;促进脯氨酸(Pro)的累积,延缓幼苗叶片的水分散失(P<0.05);可诱导超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性升高,减缓丙二醛(MDA)的积累,显著缓解因渗透胁迫诱导的细胞膜脂过氧化过程(P<0.05),增强其抗渗透胁迫能力,且随着胁迫程度的加剧效果越佳。0.5 mmol·L^-1SNP处理对黑麦草幼苗生长影响不显著,促进保护酶活性及缓解氧化损伤的作用较0.1 mmol·L^-1SNP处理显著减弱。外源NO诱导植物水分及抗氧化酶系活性的变化,是植物在渗透胁迫下维持正常生长的重要抗逆生理机制。     

两种黑麦草砷吸收特征及其与茎叶营养元素积累的关系研究

采用盆栽实验研究了100 mg·kg^-1砷(As)胁迫下,一年生黑麦草和多年生黑麦草生长情况以及老叶、功能叶、新叶、茎、根系5个部位As吸收特征及其与茎叶营养元素积累的关系。结果表明,一年生黑麦草As耐性优于多年生黑麦草,株高和根长分别只降低13.3%和3.3%,两种黑麦草5部位干重都呈现降低趋势,但多年生黑麦草老叶和一年生黑麦草根系未达显著水平。两种黑麦草不同部位As分配均表现为根系>老叶>茎>功能叶>幼叶,且多年生黑麦草对As的吸收能力优于一年生黑麦草;茎叶对N、P、K 3种元素的吸收均呈现新叶>功能叶>老叶,对Ca、Mg、Mn 3种元素的吸收则呈现老叶>功能叶>新叶;植物体内As与Mg呈极显著负相关关系,与其他营养元素相关性在两种黑麦草不同部位间表现不同。     

北大营示范场黑麦草引种与品比试验研究

利用1998年2－11月在云南省北大营示范场引种的10个黑麦草品种的观测资料，统计分析了在高、中、低3种施肥水平下黑麦草的累计产量、月平均产量及其生长速度的变化规律，研究了影响产量的主导因子及其监测模型。结果表明，在10个品种中，伯生（Bison Intermdiate）及安巴瑟（Embassy）具有良好的生产性能。黑麦草产量主要受气候、土壤肥力及品种等因素的影响，其中测草盘高度、降水量、蒸发量、日照时数和牧草生长天数等5个因子，可以较好地模拟、评估黑麦草产量的变化动态。     

Lolitrem B residue in fat tissues of cattle consuming endophyte-infected perennial ryegrass straw.

Lolitrems are neurotoxins found in endophyte-infected perennial ryegrass. Lolitrems, primarily lolitrem B, are the causative agents of ryegrass staggers in livestock. To guarantee the safety of meat produced from cattle consuming endophyte-infected perennial ryegrass, lolitrem B concentrations in tissues of Japanese Black cattle were determined using high-performance liquid chromatography. Lolitrem B was not detected in muscle, liver, kidney, or cerebrum of a Japanese Black cow with signs of ryegrass staggers. In contrast, perirenal fat contained 210 ppb lolitrem B. Three cows that received half as much perennial ryegrass straw as the cow with ryegrass staggers showed no clinical signs of ryegrass staggers. However, low concentrations of lolitrem B (less than 150 ppb) were detected in their fat tissue. These observations indicate that human exposure to the neurotoxic effect of lolitrem B through beef is unlikely. The amount of lolitrem B consumed by cattle can be estimated by the determination of lolitrem B in fat tissue.