金定鸭FSHR基因第1～7外显子的克隆及SNP位点的筛查

动物的繁殖活动主要受内分泌生殖激素的调控,FSHR存在于卵泡颗粒细胞膜上,属于G蛋白偶联受体家族,对动物卵巢细胞的发育、成熟和排卵具有重要的作用。本研究以高产和低产金定鸭基因组为模板,通过PCR扩增、目的基因片段克隆和测序等方法,获取金定鸭FSHR基因1~7外显子序列,并对基因序列进行比对分析。结果显示,序列a包含第1外显子(185bp)的完整序列,第1内含子(145bp)的部分序列;序列b包含第2(75bp)、3外显子(75bp)、第2内含子(463bp)的完整序列,第1(40bp)、3内含子(47bp)的部分序列;序列c包含第4外显子(75bp)的完整序列,第3(180bp)、4内含子(55bp)的部分序列;序列d包含第5外显子(78bp)的完整序列,第4(232bp)、5内含子(56bp)的部分序列;序列e包含第6(69bp)、7外显子(75bp)、第6内含子(117bp)的完整序列,第5(133bp)、7内含子(146bp)的部分序列。根据基因序列特征,对获取的5段金定鸭FSHR基因序列进行扩增序列测序比对。结果发现:在外显子1第50bp处存在A/G突变;在外显子2第30bp处存在A/G突变;在外显子4第33bp处存在C/T突变;在外显子5第45bp处存在A/G突变,第19bp处可能存在A/T突变,33bp处可能存在C/T突变。金定鸭FSHR基因序列的克隆及SNP突变位点的发现可为后续开展FSHR基因的多态性与金定鸭产蛋性能的相关研究奠定一定的基础。     

山西猪伪狂犬病毒gE基因主要抗原区的遗传变异分析

根据Gen Bank中收录的PRV Becker株的gE基因序列,设计了合成1对引物,对山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE部分基因进行了PCR扩增,并进行克隆与序列分析。经测序,山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE部分基因核苷酸序列长度为997 bp,编码322个氨基酸。测序后对山西流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列和推导出的氨基酸序列与18株PRV参考株进行了遗传变异分析,结果显示,山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列与18株PRV参考株之间同源性为97.8%~100%,其中与YY株(湖南)、SC-1-2015株(四川)、HNXX2012株(湖北)、HN-DZ株(广东)及DL14-08株(长春)同源性最高,均为100%,与75V19株(比利时)同源性最低,为97.8%。山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列推导的氨基酸序列与18株PRV参考株之间同源性为96.1%~100%,其中与YY株(湖南)、SC-1-2015株(四川)、HNXX2012株(湖北)、HN-DZ株(广东)及DL14-08株(长春)同源性最高,均为100%,与Rice(美国)同源性最低,为96.1%。山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因序列的遗传进化分析表明,山西PRV流行株属于2012年以来分离的PRV变异株群,与YY株和HNXX2012株亲缘关系较近,与欧洲和美洲分离株亲缘关系较远。     

油松苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

利用同源克隆的方法,从油松(Pinus tabulae ormis)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的cDNA和DNA序列,cDNA序列全长2 157 bp,编码718个氨基酸,包含有完整的ORF,命名为TaPAL(GenBank登录号:JX280460).通过核苷酸序列多重比较表明,TaPAL基因与其他植物PAL基因高度同源,预测的蛋白序列包含与水稻、玉米PAL相同的脱氨基位点和催化活性位点.PAL系统进化树显示,TaPAL与松科类植物PAL聚类关系最近.另外,对比发现TaPAL基因组DNA序列与cDNA序列完全一样,表明该基因无内含子.     

葡萄砧木‘5BB’PGIP基因的克隆及生物信息学分析

以葡萄砧木品种‘5BB’(Vitis berlandieri×V.riparia)为试材,通过设计特异引物、PCR扩增,从‘5BB’基因组中得到1条全长1002 bp的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PG IP)基因序列,该序列包含1个完整的开放阅读框,与欧洲葡萄、其它果树的相应序列同源性分别为99%和68%,其推导的蛋白质序列中包含一段亮氨酸重复序列,第1~27个氨基酸残基是信号肽,三级结构与菜豆PG IP相似。     

鮸鱼EST-cSNP位点发掘及其特征分析

为发掘鮸鱼的EST-cSNP位点,以测序获得的鮸鱼脾脏4609条高质量表达序列标签(expressed sequence tags,EST)序列为源序列,利用Vector NTI 11.0软件拼接出707条重叠群(contig)序列,检测到209个可信度高的编码区单核苷酸多态性(coding-region single nucleotide polymorphism,cSNP)位点;SNP位点数在包含SNP序列中的发生概率为0.743%,在209个SNP位点中包含114个碱基转换位点、74个碱基颠换位点和21个插入缺失位点,转换与颠换比为1.54;对所鉴定的SNP位点的相关序列进行基因注释表明,这些序列包括一批与免疫抗逆相关的基因,例如主要组织相容性复合体、免疫球蛋白、T细胞受体以及各类蛋白酶等.说明所发掘的SNP将有助于促进鮸鱼的分子遗传学及分子辅助育种研究.     

兰州熊蜂气味受体家族鉴定及分析

【目的】了解兰州熊蜂(Bombus lantschouensis)基因组中气味受体基因(odorant receptors,Ors)情况,为进一步分析气味受体功能提供信息,从而为研究该基因家族在熊蜂觅食、交尾、通讯等行为中的重要功能打下基础。【方法】提取兰州熊蜂胸部基因组DNA,进行Illumina高通量测序,对测序所得原始序列进行质控并拼接获得基因组序列,然后使用本地blast 2.2.28+对构建兰州熊蜂基因组本地数据库,使用已知的地熊蜂(Bombus terrestris)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)的气味受体蛋白序列作为种子序列搜索数据库获得兰州熊蜂的气味受体序列;使用EMBOSS1.5对气味受体蛋白序列进行基本理化分析,利用GSDS2.0对家族序列的内含子与外显子位置进行分析,然后使用MEME 4.11.2对氨基酸序列进行保守基序分析,最后利用Clusta W 2.1、Trim Al 1.2、Phy ML3.0对兰州熊蜂、地熊蜂和意大利蜜蜂气味受体家族序列进行系统进化分析。【结果】共获得165个兰州熊蜂气味受体基因,包括1个非典型气味受体(olfactory receptor co-receptor,Orco)、5个假基因和159个气味受体。基因结构分析发现,气味受体家族外显子数目从4个到9个不等。其中Or 47—57的序列中外显子数量最少,为4个;Or 128—161中外显子的数量最多,为9个。根据基因结构的不同,将气味受体分为10大类型,每个类型中的序列都有相似的外显子长度与数量。Or 1—38、Or 69—85、Or 128—164这3大类所包含成员数较多(分别为38、17、37),其他7类包含成员个数都约10个,且每个类型中序列在染色体上都呈串联排布,其中Or 1—38中都包含一个较长的第一外显子。保守基序分析发现,在检索的10个保守基序中,除基序5为未知基序外,其他9个基序均包含在其保守结构域(7tm_6 domain)中。Or1—38与Or 39—46多数成员包含全部10个保守基序,基序2、3、4、9广泛存在于该家族成员序列中,这4个基序可能为该家族关键的功能区域。系统发育分析将Ors分为5个亚家族(I—V),其中亚家族II包含2种基因结构类型序列(Bl Or 97—100与Bl Or 69—85),亚家族V包含4种(Bl Or 1—46、47—57、86—95和101—107)。Bl Or 150—155与Am Or 122—139分别聚为两个分支,Bl Or 47—57与Am Or 63—65也发现类似的聚类,这表明在进化中,蜜蜂与熊蜂的Ors出现了特异性的扩张与缺失。在进化树中发现Or 115较早与其他成员分离,位于树的基部,推测该序列可能更接近气味受体家族的祖先序列。【结论】探明了兰州熊蜂的Or基因数量、基因结构及其进化关系;该基因家族在进化过程中部分成员保守基序丢失,这些结果为进一步了解Or基因功能打下了基础。     

乌鳢免疫球蛋白M重链和免疫球蛋白轻链的克隆与特征分析

应用RACE-PCR方法克隆并鉴定了乌鳢免疫球蛋白M(i mmunoglobulin M,Ig M)重链(H)和免疫球蛋白轻链(L)全长cDNA。乌鳢IgH cDNA全长1 912个核苷酸(nt),包含1 797 nt的开放阅读框,编码598个氨基酸(aa)。IgH恒定区(CH)均包含1对保守的半胱氨酸残基形成链内二硫键,其中CH1区氨基末端存在保守的半胱氨酸残基与轻链形成链间二硫键,4个推测的N-糖基化位点(NXT和NXS)则分别位于CH1、CH2和CH4。序列比对发现乌鳢IgHCH1与CH2交界处氨基酸序列的插入使铰链区肽段较其他硬骨鱼IgH长,此外IgH CH4区羧基末端参与单体间聚合的半胱氨酸被赖氨酸替换,这反映乌鳢IgH分子结构的特异性。序列相似性比较显示乌鳢IgH与点带石斑鱼、黑鳍冰鱼、牙鲆、虹鳟的相似性依次为55%、50%、45%和36%,与斑马鱼类的相似性较低(为28%)。乌鳢IgL cDNA全长941 nt,包含729 nt的开放阅读框,编码242个aa。轻链可变区(VL)和恒定区(CL)均包含保守的半胱氨酸,形成链内和链间二硫键。序列比对分析表明乌鳢IgL与五条鰤和花狼IgL的相似性为78...     

条斑紫菜叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA克隆和序列分析(英文)

利用已知甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的特征性保守区域合成探针,并对条斑紫菜cDNA文库进行筛选,获得了一个编码叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GapA)的全长cDNA克隆(GAP4)。GAP4包含了全长的叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA序列,编码72个氨基酸的信号肽和338个氨基酸的成熟蛋白。将获得的GapA蛋白的氨基酸序列与其它物种的GAPDH序列进行多重序列比较后,发现条斑紫菜的GapA氨基酸序列都包含了4个高度保守的结构域。条斑紫菜GapA的cDNA序列中GC含量很高(64.2％),与紫菜EST分析中得到的结果(65.2％)近似。通过GAPDH的分子系统发育分析,对红藻的分类地位进行了初步探讨。条斑紫菜叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA序列已登记到GenBank数据库,序列号为:AY273819。     

条斑紫菜叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA克隆和序列分析

利用已知甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的特征性保守区域合成探针,并对条斑紫菜cDNA文库进行筛选,获得了一个编码叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GapA)的全长cDNA克隆(GAP4)。GAP4包含了全长的叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA序列,编码72个氨基酸的信号肽和338个氨基酸的成熟蛋白。将获得的GapA蛋白的氨基酸序列与其它物种的GAPDH序列进行多重序列比较后,发现条斑紫菜的GapA氨基酸序列都包含了4个高度保守的结构域。条斑紫菜GapA的cDNA序列中GC含量很高(64.2％),与紫菜EST分析中得到的结果(65.2％)近似。通过GAPDH的分子系统发育分析,对红藻的分类地位进行了初步探讨。条斑紫菜叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA序列已登记到GenBank数据库,序列号为:AY273819。     

红麻查尔酮合成酶及其异构酶基因的克隆与表达分析

[目的]克隆红麻查尔酮合成酶(CHS)及其异构酶(CHI)基因并构建CH基因的植物表达载体,为进一步研究其在红麻育性及抗逆性中的作用奠定基础.[方法]提取红麻不育系(P3A)、保持系(P3B)花药RNA和DNA,以红麻花药转录组高通量测序数据为基础,利用同源克隆技术获得CHS和CHI基因,并利用载体重组技术构建CHS基因植物表达载体.[结果]红麻CHS基因cDNA全长序列为1236 bp,包含一个1170bp开放阅读框,编码389个氨基酸;其DNA序列全长为1329bp,包含2个外显子和1个内含子.CHI基因cDNA序列为724 bp,最大开放阅读框为630bp,编码209个氨基酸;其DNA序列全长为1087 bp,包含4个外显子和3个内含子.[结论]成功克隆获得红麻CHS和CHI基因的序列,构建的CHS基因植物表达载体pBI121-CHS可用于该基因功能的研究.     

白菜型冬油菜铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD） 基因的克隆及表达分析

【目的】了解SOD酶蛋白家族Fe-SOD在超强抗寒冬油菜中的表达情况及其在低温胁迫下的作用。【方法】采用RT-PCR技术克隆超强抗寒白菜型冬油菜陇油7号Fe-SOD的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用半定量以及相对定量RT-PCR研究Fe-SOD在低温胁迫下的表达模式,采用氮蓝四唑（NBT）光还原法测定冬油菜叶片和根中的总SOD酶活性。【结果】获得Fe-SOD,GenBank登录号为KF178713,该基因cDNA片段全长645 bp,包含一个639 bp完整的开放阅读框,编码212个氨基酸的蛋白质,与白菜(Chiifu)的蛋白质氨基酸序列同源性高达99%。该基因编码的酶蛋白是1个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白,无信号肽,无跨膜结构域。Fe-SOD表达模式分析显示初期低温胁迫下（4℃）,该基因上调表达,继续低温胁迫处理（-4℃和-8℃）,Fe-SOD表达量受到抑制。总SOD酶活性测定显示冬油菜根中酶活性高于叶片,以利于冬油菜安全越冬。【结论】从白菜型冬油菜克隆的Fe-SOD具有已知物种Fe-SOD的特征。Fe-SOD在冬油菜品种陇油7号抗寒过程中起作用。     

蒺藜苜蓿低温胁迫响应基因MtbHLH-1的克隆及功能分析

【目的】克隆蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）低温胁迫响应基因MtbHLH-1,并对其进行序列特征分析,研究MtbHLH-1对牧草蒺藜苜蓿耐低温能力的影响。【方法】利用RT-PCR技术获得蒺藜苜蓿MtbHLH-1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR研究MtbHLH-1的低温（4℃）表达模式。【结果】测序结果显示,cDNA片段全长778 bp,包含一个741 bp完整的开放阅读框,编码246个氨基酸残基,命名为MtbHLH-1,GenBank登录号为JN800447。氨基酸BLAST分析表明,MtbHLH-1氨基酸序列与已报道的其它植物（大豆、拟南芥、烟草、小麦和玉米等）bHLH氨基酸序列具有45%-73%相似性。半定量RT-PCR研究表明,MtbHLH-1在低温胁迫条件下上调表达。【结论】从蒺藜苜蓿中克隆了低温胁迫碱性/螺旋-环-螺旋转录因子MtbHLH-1,半定量分析表明其在蒺藜苜蓿抗冷过程中起作用。     

SD-大白鼠催乳素受体基因的克隆与表达

应用RACE—PCR技术,克隆了全长2743bp的SD-大白鼠催乳素受体基因（gPRLR）cDNA。序列分析表明,cDNA含421bp 5′UTR、1357bp编码区和218bp3′U,UTR。比对奶牛催乳素受体基因并将前217bp看作第1外显子,则gem基因可划分为13个外显子。推导的蛋白序列含763个氨基酸,与奶牛、鸽及猪PRLR的同源性较高,其N末端含23个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含789个氨基酸。gPRLRmRNA在成年鼠睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达。     

中国环颈雉心脏型脂肪酸结合蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

运用RT-PCR技术,克隆了中国环颈雉心脏型脂肪酸结合蛋白基因的序列,并对其进行了测序及生物信息学分析。结果表明:中国环颈雉H-FABP基因cDNA序列长为402bp,开放阅读框为399bp,编码132个氨基酸,推测的蛋白相对分子质量为14.64KD,等电点为6.30。中国环颈雉H-FABP基因与已报道的鸡、鸭、珍珠鸡等禽类动物的核苷酸和编码氨基酸序列具有很高的相似性。     

油菜BnICE1的克隆及表达分析

【目的】从超强抗寒油菜品种陇油6号中克隆抗寒转录因子BnICE1,并对其进行序列特征分析,研究BnICE1在低温胁迫下表达水平的变化,探讨BnICE1对油菜耐低温胁迫能力的影响。【方法】利用RACE技术获得油菜BnICE1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR研究BnICE1低温及不同组织表达量。【结果】cDNA片段全长1 737 bp,包含1 500 bp完整的开放阅读框,该基因编码499个氨基酸残基,分子量53.2 kD,等电点5.0。序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其它植物的ICE1蛋白具有较高的同源性,因此命名为BnICE1（GenBank登录号为JF268687）。进化树分析表明,BnlCE1同羊草和白菜亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在油菜茎、叶和下胚轴均有表达,下胚轴中表达量最高,同时该基因的表达受低温胁迫诱导。【结论】从油菜中克隆了抗寒基因BnICE1,实时荧光定量PCR分析表明其在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

稀有鮈鲫雄激素受体基因的克隆和内分泌干扰物对其表达的影响

采用RT-PCR和RACE法分离了稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)精巢雄激素受体基因(AR)的cDNA,其核苷酸序列3 130 bp,编码844个氨基酸。它的氨基酸序列与鲤科鱼类AR的同源性较高。AR基因在稀有鮈鲫的性腺、肝、脑、肠和肌肉等组织中均有表达,在雄性个体中精巢和肝脏的表达量最高,其他组织较低,而在雌性个体除肌肉中表达量较低外,其他组织均为中等水平的表达。0.01和0.1 nmol/L的乙炔基雌二醇暴露3 d后,能够分别非显著和显著地提高稀有鮈鲫幼鱼AR的mRNA表达,而1 nmol/L的乙炔基雌二醇则对其表达有下调的趋势,0.1~10 nmol/L的双酚A对其表达均有显著下调,0.01μmol/L壬基酚对其表达有显著下调,而0.1和1μmol/L壬基酚对其表达均有下调的趋势,因此不同种类内分泌干扰物及其不同暴露浓度对稀有鮈鲫AR的mRNA表达有不同影响。     

烟草DREB转录因子新基因的克隆与功能分析

采用同源克隆及cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE),从烟草中克隆到1个新的烟草DREB基因,命名为NbDREB2a.序列分析表明该基因全长1191 bp,编码330个氨基酸,具有典型的DREB转录因子保守的AP2结构域.实时RT-PCR分析表明,该基因能在烟草的根、茎、叶中表达,受低温、干旱和高盐诱导.酵母转录激活实验证明,该基因可以特异性结合DRE顺式作用元件,并能激活报告基因的表达.为了研究该基因在植物抗逆反应中的功能,利用农杆菌介导法,将该基因转化到模式生物拟南芥中,筛选到了单拷贝插入的、纯合的拟南芥株系;对获得的转基因拟南芥进行干旱及高盐处理,结果表明,与对照相比,超量表达该基因能够明显地提高拟南芥对干旱及高盐的抗性.     

黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶全长DNA的克隆及表达分析

【目的】克隆黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的cDNA,并进行生物信息学和表达分析,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】通过对乙烯利诱导黄瓜茎尖SSH文库的筛选,采用RT-PCR 和电子克隆技术,获得黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长序列(NCBI编号：HQ444960, CsSAHH)。运用半定量RT-PCR,分析CsSAHH基因在乙烯利诱导后的茎尖和雌雄花不同部位的表达。通过生物信息学方法预测CsSAHH基因的蛋白结构。【结果】黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长1 545 bp,编码485个氨基酸,其理论上的等电点pI＝5.66,分子量MW＝53.1 kD。CsSAHH基因在黄瓜茎尖受乙烯利诱导增强表达,在黄瓜雄花中的雄蕊表达较弱。CsSAHH理化性质表明,该蛋白无明显的信号肽;蛋白二级结构主要由loop 环和α螺旋构成,含少量的β折叠,预测发现该蛋白分别在85-99 氨基酸残基和262-279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。CsSAHH基因氨基酸序列与苜蓿的同源性为63%,与水稻、玉米、拟南芥等作物同源性较低。【结论】成功克隆黄瓜CsSAHH基因cDNA序列,在85-99 氨基酸残基和262-279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。该基因在茎尖受乙烯利诱导增强表达,在雄蕊中表达较弱。在未处理的雌雄花芽发育不同阶段,雌花芽中表达强于幼果和雄花芽。     

In Silico Cloning and Sequence Analysis of Phospholipase Dα Gene from Peach Fruit

Phospholipase D （PLD, EC 3.1.4.4） plays an important role in adaptive response of postharvest fruit to environment. In this study, a novel cDNA of PLDα was isolated with the strategy of in silico cloning in combination with RT-PCR from peach （Prunus persica L. cv. Jiubao）. The obtained PLDα gene contained a complete open reading frame encoding a 92- kDa protein of 810 amino acid residues, which possessed the characteristic C2 domain and two catalytic HKD motifs. The alignment analysis of the deduced peach PLDa protein with other known PLDα family proteins indicated that peach PLDα was conserved and highly homologous with strawberry PLDα. Semi-quantitative RT-PCR and Northern blot analysis indicated PLDα mRNA in peach fruits could be induced by low temperature. This work provided a scientific basis for further investigating the mechanism of postharvest fruit adaptation to low temperature.