基于EST-PCR的簇毛麦染色体特异分子标记筛选及应用

为定位、转移和利用簇毛麦有益基因, 通过花粉辐射, 获得一批包括小麦-簇毛麦易位染色体的异染色体系。为了鉴定这批材料中的簇毛麦染色体身份, 根据水稻、小麦的EST序列合成了240对STS引物, 其中34对引物在普通小麦中国春与簇毛麦间存在多态性;进一步对亲本及簇毛麦二体异附加系进行PCR扩增分析, 标记CINAU32_-300可追踪簇毛麦1V染色体, 标记CINAU33_-280、CINAU34_-510、CINAU35_-1100、CINAU36_-380和CINAU37_-400可追踪簇毛麦2V染色体, 标记CINAU38_-250可追踪簇毛麦3V染色体, 标记CINAU39_-950和CINAU40_-800可追踪簇毛麦4V染色体, 标记CINAU41_-745和CINAU42_-1050可追踪簇毛麦5V染色体, 标记CINAU44_-765和CINAU45_-495可追踪簇毛麦7V染色体。加上本室已开发的2个6V染色体特异标记, 用这些簇毛麦特异分子标记鉴定辐射诱导材料的部分回交后代, 选育出小麦背景中只包含单条簇毛麦染色体的整套1V至7V染色体系, 同时有18条易位染色体的簇毛麦身份得到确定, 表明这些标记可以用来快速检测普通小麦背景中的簇毛麦染色体或染色体片段。     

普通小麦近缘物种黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk#1染色体特异分子标记的筛选

为筛选普通小麦近缘物种黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk^#1染色体特异分子标记，根据已定位于普通小麦第一部分同源群的EST序列设计104对STS引物，对中国春、鹅观草、黑麦及簇毛麦进行多态性分析。在104对STS引物中，有53对在对照普通小麦中国春与鹅观草、黑麦及簇毛麦之间存在多态性。利用普通小麦-黑麦1R~7R二体异附加系筛选出5对黑麦1R染色体特异标记，分别是CINAU 19-₅₀₀、CINAU20-₉₅₀、CINAU21-₁₅₀₀、CINAU22-₃₁₀和CINAU23-₂₀₀₀；利用普通小麦-簇毛麦1V~7V二体异附加系筛选出5对簇毛麦1V染色体特异标记，分别是CINAU23-₁₇₀₀、CINAU24-₁₀₅₀、CINAU25-₁₆₅₀、CINAU26-₅₀₀和CINAU27-₆₂₀；利用鹅观草二体异附加系DA1Rk^#1、异代换系DS1Rk^#1(1A)、端体系DA1Rk^#1L、易位系T1Rk^#1S·W、长臂缺失系Del1Rk#1L筛选出5对鹅观草1Rk^#1特异标记，分别是CINAU27-₉₆₀、CINAU28-₁₃₆₀、CINAU29-₄₈₀、CINAU30-₅₆₀和CINAU31-₅₂₀。研究表明，可以利用普通小麦的EST序列设计PCR引物，转化成STS标记，筛选普通小麦近缘物种黑麦、簇毛麦及鹅观草等染色体特异的分子标记，快速检测和追踪导入普通小麦背景中的黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk^#1染色体或染色体片段，为深入研究普通小麦远缘杂种材料提供新的工具。     

不同簇毛麦6VS染色体臂的白粉病抗性特异功能标记的开发及应用

小麦6VS·6DL易位系Pm97033和6VS·6AL易位系92R137中的6VS染色体臂来自不同的簇毛麦种质,均表现良好的白粉病抗性,本研究利用分子标记对这2个易位系所包含抗病基因的异同进行了鉴定。利用与Pm21抗白粉病相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Stpk-V基因(GenBank登录号为HQ864471.1)的基因组和cDNA序列为基础,在包含至少1个内含子的2个编码区设计引物,从Pm97033中扩增获得特异的多态性片段。为进一步提高特异性和扩增的稳定性,对特异扩增片段测序并重新设计引物,扩增筛选获得2个引物对,其中PK-F1/PK-R可专一扩增6VS·6DL易位系Pm97033及其抗病亲本,而PK-F2/PK-R可同时特异扩增2个不同来源的簇毛麦6VS染色体,但二者间的特异片段具有多态性。利用这2对引物,对系谱中包含6V(6D)和6VS·6AL、抗白粉病的小麦品系CB037进行检测,发现仅出现与6VS·6AL易位系相同的簇毛麦扩增片段,不存在簇毛麦No. 1026 (Pm97033的6VS供体)的扩增片段。基因组原位杂交结果表明,CB037仅含1对小麦-簇毛麦的易位染色体,用已报道的分子标记检测证明易位涉及的小麦染色体为6A,与本研究开发的分子标记检测结果相吻合,表明CB037携带的白粉病抗性基因来自6VS·6AL易位系92R137,其白粉病抗性可能与Pm97033具有不同的遗传基础。     

簇毛麦6VS上4个新分子标记的鉴定及与抗白粉病基因Pm21的连锁分析

Pm21具有强抗白粉病特性，位于簇毛麦6V染色体短臂（6VS）上。染色体分析和白粉病抗性检测表明，Pm21在受体小麦内是稳定遗传的。筛选与Pm21相连锁分子标记，在小麦抗白粉病辅助选择育种上有重要意义。利用RAPD和AFLP分子标记方法，对簇毛麦6V染色体和含有6V的小麦-簇毛麦代换系、6VS的易位系6AL/6VS、6DL/6VS进行分子标记筛选，以分析位于6VS上的分子标记及其与Pm21的关系。RAPD检测表明，OPK08910特异片段存在于含簇毛麦6V染色体的代换系（6A/6V）、易位系（6AL/6VS，6DL/6VS）和簇毛麦中。AFLP检测显示，PstⅠ+AGG / MseⅠ+CAC、PstⅠ+ACC / MseⅠ+CCT和PstⅠ+ AAG / MseⅠ+CGC 共3对引物分别可以在6A/6V、6AL/6VS、6DL/6VS和VV中扩增出264 bp、218 bp和232 bp特异带，并与抗白粉病基因Pm21共分离，因此，上述来源于6VS上的4个新的分子标记，可作为源自簇毛麦Pm21基因的选择标记，用于小麦抗病育种。     

基于改进的多色荧光原位杂交技术的染色体分析

为了提高多色荧光原位杂交(M-FISH)技术的鉴定效率,简化M-FISH操作程序,探索和建立新的M-FISH实验及观察体系,本研究以‘荆辉1号’（普通小麦辉县红-荆州黑麦双二倍体）、‘南农9918’（普通小麦-簇毛麦整臂易位系T6VS.6AL）、‘扬麦22’（普通小麦-簇毛麦整臂易位系T6VS.6DL）以及‘ST5V#4S-1’（普通小麦-簇毛麦小片段易位系）等为试验材料,以2个寡核苷酸探针[(GAA)₁₀、pAs1-1]和物种基因组DNA探针作混合探针进行M-FISH分析。结果表明在一次原位杂交中同时使用3种探针,既可以识别出小麦背景中所有的外源染色体或染色体片段,又可以根据(GAA)₁₀和pAs1-1在染色体上的杂交信号分布精确鉴定出小麦和外源染色体（片段）的具体身份。这种改进的M-FISH技术可有效用于小麦及其近缘植物染色体的鉴定,并有助于快速构建物种基于FISH的分子核型。     

小麦-簇毛麦染色体代换系、易位系Ⅴ染色体RAPD标记筛选

利用105条S系列和100条Operon随机引物,对小麦一簇毛麦代换系(6V／6A)、两个易位系(6VS／6AL,6VS／6DL)及亲本簇毛麦(VV)、硬粒小麦(AABB)、栽培小麦(AABBDD)的多态性进行了筛选分析。80．95％的S系列引物扩增出了结果,且条带较清晰;在100条OP系列引物中均扩增出结果,条带清晰可见。从205个随机引物中发现,只有1个引物OPW03在含有簇毛麦V染色体的4个材料中均扩增出l条约570bp的谱带,而在栽培小麦和硬粒小麦中没有发现。因此,可以推测这个分子标记(OPW03—570)是位于簇毛麦V染色体短臂上的。     

普通小麦–簇毛麦种质对菲利普孢囊线虫的抗性分析

菲利普孢囊线虫(Heterodera filipjevi)是在我国新发现的一种小麦病原线虫, 已严重威胁我国小麦的安全生产。小麦近缘种属具有改良小麦所需的许多目标性状, 是丰富小麦遗传变异、选育抗病品种的重要基因资源。采用室内接种鉴定法, 从20份小麦近缘属种材料中发现簇毛麦(Dasypyrum villosum)高抗H. filipjevi。分别对3套普通小麦–簇毛麦染色体附加系和6VS易位系进行接虫抗性鉴定, 结果6V染色体附加系高抗H. filipjevi;含6VS的易位系则表现感病。据此推测, 簇毛麦6V染色体上可能含有抗H. filipjevi基因, 且可能位于6VL上。     

利用SDS-PAGE和AS-PCR标记鉴定簇毛麦HMW-GS基因

本研究通过SDS-PAGE和AS-PCR标记对簇毛麦HMW-GS进行鉴定,对于快速鉴别导入到普通小麦中的簇毛麦HMW-GS和改良普通小麦品质具有重要意义。利用SDS-PAGE对中国春、钱尼、簇毛麦、6个中国春-簇毛麦二体附加系、普通小麦-簇毛麦3V异代换系进行HMW-GS组成分析,进一步确定簇毛麦HMW-GS基因位于1V染色体。根据已发表的普通小麦HMW-GS基因序列同源性比较结果,设计了3对分别扩增普通小麦x-型亚基基因、y-型亚基基因以及所有HMW-GS基因的特异引物。经过对簇毛麦HMW-GS基因进行扩增发现,这3个AS-PCR标记都能很好地鉴别簇毛麦HMW-GS编码基因,并从分子水平上把簇毛麦HMW-GS基因定位于簇毛麦1V染色体上。     

簇毛麦1V染色体的传递及品质效应分析

簇毛麦是小麦的一个野生近缘种,小麦-簇毛麦1V异附加系和异代换系的蛋白质含量和沉降值均高,将簇毛麦1V染色体的优质基因导入普通小麦,进一步创造小麦-簇毛麦1V染色体易位系是小麦品质改良的有效途径.以小麦-簇毛麦1V异染色体系材料为基础,用普通小麦连续回交,结合原位杂交和PCR标记鉴定方法,分析1V染色体以及1V结构变异...     

普通小麦-簇毛麦易位系T4VS·4VL-4AL的选育与鉴定

利用染色体C-分带和基因组原位杂交分析,从普通小麦-簇毛麦4V染色体二体异附加系（DA4V）与普通小麦农林26-离果山羊草3C染色体二体异附加系（DA3C）杂种后代中选育出小麦-簇毛麦纯合易位系T4VS·4VL-4AL。SSR和RFLP标记分析表明,该易位染色体包括4VS、4VL近着丝粒部分区段和4AL顶端区段;该易位系具有良好的细胞学稳定性,结实正常,为杀配子染色体诱发形成的补偿型易位;易位系T4VS·4VL-4AL高抗梭条花叶病,是小麦抗病育种新种质。     

Development and identification of wheat–Haynaldia villosa T6DL.6VS chromosome translocation lines conferring resistance to powdery mildew

Three lines conferring resistance to powdery mildew, Pm97033, Pm97034 and Pm97035, were developed from the cross of Triticum durum-Haynaldia villosa amphidiploid TH3 and wheat cv.'Wan7107' via backcrosses, immature embryo and anther culture. Genomic in situ hybridization analysis showed that these lines were disomic translocation lines. Cytogenetic analysis indicated that the F1 plants of crosses between the three translocation lines and 'Wan7107' and crosses between the three translocation lines and substitution line 6V(6D) formed 21 bivalents at meiotic metaphase I. Aneuploid analysis with 'Chinese Spring' double ditelocentric stocks indicated that the translocated chromosomes were related to chromosome 6D. Biochemical and restriction fragment-length polymorphism (RFLP) analyses showed that the translocation lines lacked a specific band of 6VL of H. villosa compared with the substitution and addition lines but possessed specific markers on the short arm of the 6V chromosome of H. villosa. The three translocation lines lacked specific biochemical loci and RFLP markers located on chromosome 6DS. The results confirmed that Pm97033, Pm97034 and Pm97035 were T6DL.6VS translocation lines.     

一个花粉辐射诱导的小麦-簇毛麦相互易位染色体系的分子细胞遗传学研究

利用⁶⁰Co-γ-射线处理小麦-簇毛麦6V单体添加系花粉，并给中国春授粉，在一个M1单株减数分裂中期Ⅰ检测到一个由2条小麦-簇毛麦易位染色体和一条完整小麦染色体构成的三价体，说明参与易位的2个小麦片段均来自同一条小麦染色体，推测两条易位染色体由相互易位产生。将其中涉及外源大片段的易位染色体称为外源大片段易位（large alien segment translocation, LAST），涉及外源小片段的称为外源小片段易位(small alien segment translocation, SAST)。对后代中两个易位染色体均纯合的植株（LAST’’+SAST’’, 2n = 44）进行顺次C-分带和GISH研究，结果表明外源大片段易位染色体为T7BS-6VS•6VL，外源小片段易位染色体为T6VS-7BS•7BL，易位断点分别位于7B染色体短臂约FL0.60处及6V染色体短臂约FL0.70处。在M2代群体中检测到7种染色体组成类型，比例为3(LAST’’+SAST’’)∶20(LAST’+SAST’)∶2(LAST’’+SAST’)∶1(LAST’+SAST’’)∶1LAST’∶2SAST’∶22(0型)，其中外源大片段和外源小片段易位染色体往往相伴出现。抗病鉴定结果显示抗白粉病基因位于外源大片段易位染色体T7BS-6VS•6VL上。对LAST’+SAST’型（2n = 43）M₂代单株花粉母细胞减数分裂的GISH研究结果显示，88.5%的后期Ｉ或末期Ｉ细胞中出现T6VS-7BS•7BL和T7BS-6VS•6VL的共分离。此外，在个别后期Ｉ细胞中观察到外源大片段易位染色体T7BS-6VS•6VL发生落后和着丝粒断裂现象，并在LAST’型单株（2n =42）的自交后代中筛选到一个通过着丝粒断裂-融合产生的外源小片段插入易位T7BL•6VS-7BS，这为利用外源大片段易位进一步创制携带抗病基因的小片段插入易位提供了新的思路。还分别获得了T7BS-6VS•6VL和T6VS-7BS•7BL的纯合易位系。     

SSR and STS markers for wheat stripe rust resistance gene <Emphasis Type="Italic">Yr26</Emphasis>

Stripe (yellow) rust, caused by Puccinia striiformis f. sp. tritici (Pst), is one of the most devastating wheat diseases worldwide. Triticum aestivum-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines carrying the Yr26 gene on chromosome 1B, are resistant to most races of Pst used in virulence tests. In order to better utilize Yr26 for wheat improvement, we attempted to screen SSR and EST-based STS markers closely linked with Yr26. A total of 500 F₂ plants and the F_2:3 progenies derived from a cross between 92R137 and susceptible cultivar Yangmai 5 were inoculated with race CYR32. The analysis confirmed that stripe rust resistance was controlled by a single dominant gene, Yr26. Among 35 pairs of genomic SSR markers and 81 pairs of STS markers derived from EST sequences located on chromosome 1B, Yr26 was flanked by 5 SSR and 7 STS markers. The markers were mapped in deletion bins using CS aneuploid and deletion lines. The closest flanking marker loci, Xwe173 and Xbarc181, mapped in 1BL and the genetic distances from Yr26 were 1.4 cM and 6.7 cM, respectively. Some of these markers were previously reported on 1BS. Eight common wheat cultivars and lines developed from the T. aestivum-H. villosa 6VS/6AL translocation lines by different research groups were tested for presence of the markers. Five lines with Yr26 carried the flanking markers whereas three lines without Yr26 did not. The results indicated that the flanking markers should be useful in marker-assisted selection for incorporating Yr26 into wheat cultivars.     

若干小麦抗白粉病品系的有效抗病基因的测定

采用具有不同毒性基因的白粉菌菌株进行苗期接种，通过与已知抗病基因材料抗谱的相似性比较，对１７个抗白粉病育种品系的有效抗病基因进行了分析，其中３个阿拉拉特小麦杂种后代品系、４个Ｖ．Ｐ．Ｍ系统的杂种后代品系及另外１个杂交组合的后代品系含主效抗病基因Ｐｍ２；４个具有Ｖ．Ｐ．Ｍ或Ｃ３９血缘的品系及另外１个品系含主效抗病基因Ｐｍ４ ｂ；１个品系含Ｐｍ２＋６；２个普通小麦－黑麦６Ｄ／６Ｒ代换系的抗谱相似，且不     

Efficient development of Haynaldia villosa chromosome 6VS‐specific DNA markers using a CISP‐IS strategy

Development of effective molecular markers linked to Pm21 deriving from Haynaldia villosa is critical for wheat breeding of powdery mildew resistance. In this study, we designed 12 pairs of conserved‐intron scanning primers (CISPs), using intron‐containing conserved genes located on the short arm of Brachypodium distachyon chromosome 3 (3BdS) aligned with cDNA or expressed sequence tags (ESTs) of Triticeae crops. Of 12 CISP primer pairs, 11 amplified DNA both in H. villosa and in wheat, and four displayed H. villosa chromosome 6VS‐specific polymorphisms. Six non‐polymorphic DNAs were further sequenced for designing internal primers, and five additional 6VS‐specific markers were obtained. Of the total nine 6VS‐specific co‐dominant markers, six could effectively trace Pm21 in F₂ population derived from the hybrid between the T6AL.6VS line and ‘Yangmai 158’. This study demonstrated that Brachypodium genomic information could be powerfully utilized to develop molecular markers in H. villosa or other Triticeae species.