大约克猪SLA-1原核表达载体的构建及表达

为构建大约克猪SLA-1胞外区的原核表达载体及表达目的蛋白,试验设计1对引物,经PCR扩增获得大约克猪SLA-1胞外区基因（命名为SLA-1-DYKe）,将此片段克隆至pMD^®19-T Simple Vector,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切筛选阳性克隆菌并测序,将目的基因插入到原核表达载体pET-28a（+）中,转化至宿主菌BL21（DE3）进行诱导表达,用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况,大量诱导提取包涵体并检测。结果显示,PCR成功扩增SLA-1-DYKe的胞外区,得到大小为837 bp的目的基因,目的基因成功克隆至pMD^®19-T Simple Vector,并获得序列正确的重组质粒。以得到的重组质粒成功构建了SLA-1-DYKe/pET-28a（+）表达载体,目的蛋白大小约为34 ku。本研究成功构建了大约克猪SLA-1原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后研究大约克猪SLA-1的空间结构和基因功能奠定了基础。     

马疱疹病毒1型ORF5基因分子特征分析及原核表达载体的构建

马疱疹病毒1型(EHV-1)对马产业造成严重的经济损失.该病的防控主要依赖疫苗免疫,但是现有的检测方法不能有效区分疫苗免疫与自然感染,给流行病学调查和疫病的防控带来了一定的阻碍.本研究聚焦EHV-1的非结构蛋白,以EHV-1 XJ2015株为研究对象,扩增ORF5基因进行其遗传进化分析、氨基酸序列差异性分析、蛋白质性质...     

应用 RACE 技术扩增柞蚕 Lectin基因及原核表达载体构建

根据其它昆虫Lectin基因同源序列分析,设计引物对,以柞蚕幼虫总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增获得了176 bp的部分柞蚕Lectin基因序列。根据获得的已知序列分别设计引物,采用3＇-RACE 和5＇-RACE 技术手段分离、克隆柞蚕Lectin基因,将编码区全长DNA序列克隆并连接至PET-28 a （＋）中构建原核表达载体。结果为后续柞蚕Lectin基因原核表达、抗体制备及其功能研究奠定基础。     

LacS基因原核表达载体构建及重组蛋白表达

克隆得到硫矿硫化叶菌中的糖苷酶基因LacS,利用原核表达载体pASK-IBA-2构建重组质粒pASK-IBA-2-LacS,酶切和测序鉴定证实LacS基因成功插入且基因阅读框正确。重组质粒pASK-IBA-2-LacS转化大肠杆菌Rosseta,去水四环素诱导后,菌液裂解离心亲和层析获得重组蛋白,western blot证实LacS在大肠杆菌Rosseta能高效表达。     

犬新孢子虫AMA1基因的生物信息学分析及原核表达载体构建

为了解新孢子虫AMA1基因的生物信息学特性,并构建重组原核表达质粒p GEX-4T-1-Nc AMA1。本试验对牛源犬新孢子虫吉林株AMA1基因进行分子克隆,利用生物信息学软件对该基因进行编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析,并将该基因片段亚克隆至原核表达载体p GEX-4T-1,构建了重组表达质粒p GEX-4T-1-Nc AMA1。结果显示,克隆的Nc AMA1基因片段长1 695 bp,与GenBank(AB265823.1)上发表的基因序列同源性99.9%;Nc AMA1基因编码蛋白等电点为5.43,在其N端及C端分别存在一个跨膜区,为不溶性蛋白,且Nc AMA1蛋白抗原指数较高,有潜在疫苗研究价值。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒pT-VP4和pT-VP7中护增VP4、VP7基因，连接至pGEM-5zf( )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒pET-28a( )，连接、转化受体菌，经PCR、酶切和序列分析证明，连接向位和阅读框架是正确的，从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体pET28a-VP4、pET28a-VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下，用SDS-PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明，表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，蛋白的分子量分别为37.69和36.20ku，表达量占菌体总蛋白的比例分别为17.1%和14.4%。     

鸡毒霉形体TM-1基因原核表达载体的构建及表达

对从含有鸡毒霉形体H3株TM-1基因的大肠埃希氏菌DH5α中提取的质粒，进行EcoR Ⅰ和Sα／Ⅰ双酶切，获得了大约为786bp的目的片段。将此片段与经EcoRⅠ和Sαl Ⅰ双酶切的线性原核表达载体pET-30a-1连接。转化宿主菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。提取质粒，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入正确，从而构建成了重组表达载体。阳性克隆用IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳分析，证明其分子质量约为29ku；Western-blotting分析表明，该蛋白可被鸡毒霉形体阳性血清识别，具有生物学活性。     

鸡去泛素化相关因子1基因原核表达载体的构建及表达

构建鸡去泛素化相关因子1(Chicken ubiquitin-related factor 1,chUAF1)的原核表达载体,并对表达产物进行鉴定.将提取的鸡法氏囊cDNA根据哺乳动物基因组的特性5'-端GC含量高3'-端GC含量低的特点设计2对引物,PCR获取2段基因片段.将两者用搭桥部分的酶切位点进行酶切,胶回收,连接成chUAF1基因全长,再将基因克隆入pMD18-T载体,酶切鉴定后,将chUAF1基因亚克隆到pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-UAF1.转化BL21(DE3)大肠杆菌中,IPTG诱导表达并鉴定.结果显示,所构建的chUAF1基因表达载体pET28a-chUAF1经PCR及DNA测序结果表明构建正确,SDS-PAGE鉴定在预期位置出现阳性条带.结果表明,已成功构建了pET28a-chUAF1原核表达载体,为下一步试验提供了依据.     

梅花鹿鹿茸表皮生长因子基因原核表达载体的构建及鉴定

通过T-A克隆技术,成功地构建了克隆载体pMD-18T-EGF,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切克隆质粒pMD-18T-EGF后,回收EGF基因,并将此基因定向克隆至相同双酶切回收后的pET32a原核表达载体中,获得重组质粒pET32a-EGF。经限制性内切酶分析和PCR鉴定,结果表明:成功地构建了原核重组质粒。     

鹅细小病毒VP2基因原核及真核表达载体的构建

将鹅细小病毒VP2基因在克隆到原核表达载体pPROEX-HTb及真核转移载体pFASTBAC-HTb中，重组真核转移载体在DH10BAC中经转座作用，成功构建了表达VP2基因的原核表达载体pPROEX-HTb-VP2和杆状病毒表达载体BAC-VP2。经限制性内切酶酶切及PCR分析，确定为阳性重组子。     

鹅细小病毒NS1基因的克隆及原核表达

本研究根据GenBank发表的GPVB株全基因核苷酸序列，设计了1对用以扩增GPV主要非结构蛋白NS1基因的引物。通过PCR技术，扩增出NS1完整基因片段1．9kb。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：GPV H1株NS1基因全长1884bp，编码627个氨基酸，与国外已发表的B株核苷酸序列同源性为98．15％。同时将该目的基因正向插入到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6P-1的BamH1多克隆位点，构建了GPV NS1的原核表达载体，成功的表达了约97KD的NS1融合蛋白。     

山羊痘病毒P32基因重组表达载体的构建及原核表达

以含山羊痘病毒贵州LD株P32基因的质粒pMD18-T-P32/LD为模板,应用PCR方法扩增P32基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET-28a-P32/LD,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,有分子量约为35.5 ku的融合蛋白获得表达,与预期结果相符;Western-Blotting证实该表达蛋白具有免疫学活性。P32蛋白的成功表达为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白原核表达载体的构建

为消除M蛋白抑茵现象使其得到稳定表达,本试验采用两种策略:一是将M基因截短得到编码M蛋白膜外区的基因序列(M'),构建重组表达载体pGEX-6p-M';二是将M基因改造,在其N端和C端同时加上GST基因,即构建pGEX-6p-M-GST重组表达栽体.     

抗ICAM-1单链抗体基因的克隆及序列分析

应用 RT- PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 ICAM- 1单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 F12中 ,扩增出抗体VH和 VL 基因 ,用 linker(Gly4 Ser) 3基因 ,将 VH和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆到 p MD18- T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 74 4 bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排鼠抗体可变区基因特征。 VH和 VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 (B)和轻链к 家族     

汉坦病毒L基因的分段克隆及原核表达

为原核表达汉坦病毒(HV)L蛋白,本研究根据HV 76-118株全长L基因序列分段设计合成了6对引物.通过RT-PCR方法分段扩增L基因的6个片段,分别克隆于原核表达载体pET-30a中,并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达.SDS-PAGE分析表明,获得与预期分子量一致的特异的目的蛋白.Western blot检测表明,重组蛋白与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应.     

犬新孢子虫吉林株SAG1基因真核表达载体的构建

根据GenBank中已发表的犬新孢子虫SAG1基因序列(AF132217),设计了一对含有Kozak序列、起始密码子、终止密码子、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物。以含有SAG1基因的重组质粒pMD-18T-SAG1为模板,经PCR扩增获得SAG1基因,利用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切该片段,回收含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点粘性末端的SAG1基因片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAX1真核表达载体中,获得重组质粒pVAX1-SAG1,经PCR鉴定、酶切分析和重组质粒的序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。     

牛肌肉生成抑制素基因功能区的克隆与原核表达

根据GenBank中牛肌肉生成抑制素（MSTN）基因序列设计了1对引物，在引物两端分别加EcoRⅠ和XhoⅠ识别位点。利用RT—PCR技术扩增出了牛MSTN功能区序列。分别构建克隆和原核表达载体，酶切、PCR鉴定及测序分析表明，该基因功能区序列的克隆载体和原核表达载体已成功构建。筛选阳性菌，经IPTG诱导，牛MSTN基因功能区在大肠埃希氏菌中成功表达。     

无芒隐子草CsLEA基因超表达载体和反义表达载体构建

根据已克隆出的无芒隐子草(Cleistogenes songorica)晚期胚胎发生丰富蛋白基因CsLEA(GenBank序列号为FJ972827)基因和植物表达载体的酶切位点特征, 分别将CsLEA基因编码区序列480 bp正向和反向插入pBI121, 构建了超表达载体pBI121 35S::CsLEA和反义表达载体pBI121 35S::AS-CsLEA。电击法转入根癌农杆菌GV3101中, 并通过花粉管通道法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana), 经卡那霉素抗性筛选和PCR鉴定, 已获得T1代阳性植株。     

抗菌肽V13KL原核表达载体的构建及其表达产物的鉴定

将V13KL编码基因片段克隆到原核表达载体pET30b（＋）,并在目的蛋白N端设计肠激酶酶切位点,构建出pET30b（＋）-VK13L重组质粒,转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）,优化诱导条件,使得抗菌肽得到了高效表达。经Tricine-SDS-PAGE和Westernblotting鉴定,目的蛋白的相对分子质量与预期一致。结果表明,V13KL基因成功克隆并且获得表达,在诱导体系中加入1mmol／LIPTG诱导6h便可检测到蛋白表达。