梭梭糖基转移酶基因克隆及序列分析

以梭梭叶片为材料,根据其他植物糖基转移酶基因的保守序列设计引物,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法克隆到2个同源的序列,分别命名为HaUGT1和HaUGT2。基因测序结果显示,HaUGT1基因编码区长1 485bp,编码495个氨基酸;HaUGT2基因编码区长1 185bp,编码394个氨基酸。HaUGT1和HaUGT2蛋白具有保守的PSPG基序、UDP-葡萄糖基转移酶结构域,与其他植物中的糖基转移酶蛋白同源性较高。     

药西瓜UDP-糖基转移酶基因的克隆与表达分析

为明确药西瓜UDP-糖基转移酶催化葫芦素形成葫芦素配糖体的表达规律,以药西瓜品种"WM9"叶片为供试材料,采用RT-PCR技术克隆药西瓜UDP-糖基转移酶基因,并对编码蛋白进行分析。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR),以ACTIN为内参基因,分析获得的2个药西瓜UDP-糖基转移酶基因在不同组织器官中的表达规律。结果表明:克隆得到2个UDP-糖基转移酶基因,分别为1 546 bp和1 559 bp的cDNA全长序列,命名为UDP-E1和UDP-E2。对扩增获得的序列进行生物学信息分析,确定UDP-E1基因的完整开放阅读框(ORF)为1 314 bp,可编码氨基酸437个,理论分子量为49.02 ku,等电点为5.99,属稳定蛋白,Genbank登录号MK576125。UDP-E2基因的ORF为846 bp,可编码氨基酸281个,理论分子量为32.78 ku,等电点为5.23,属不稳定蛋白,Genbank登录号MK576126。这2个基因属于糖基转移酶超家族。UDP-E1和UDP-E2均与香瓜、黄瓜的UDP-糖基转移酶基因序列相似性最高。在各组织器官中,UDP-糖基转移酶均有表达,且在茎中表达水平最低,叶中表达水平最高。     

杜仲EuGT4基因原核表达及其编码蛋白纯化

为进一步研究杜仲糖基转移酶结构和功能提供科学依据,利用贵州省农业生物工程重点实验室构建的杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)基因组数据库注释信息,从杜仲克隆得到1个全长为1 461bp的糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)cDNA序列,将该基因命名为EuGT4;利用基因重组技术构建原核表达载体pET30a-EuGT4,遗传转化大肠杆菌BL21(DE3);在37℃条件下,以终浓度为0.2mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导16h,并采用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱纯化蛋白,以15%SDSPAGE凝胶电泳定性分析。结果表明:EuGT4重组蛋白以包涵体形式在BL21(DE3)中表达,经SDS-PAGE凝胶电泳检测和Western Blot鉴定,在相对分子质量约50kD处有1条特异性蛋白条带,确定为杜仲EuGT4蛋白。     

黏虫UDP-葡萄糖基转移酶UGT33J12基因序列分析及对两种杀虫剂的响应

UDP-葡萄糖基转移酶是昆虫体内重要解毒代谢酶,对昆虫抗药性发挥重要作用.研究基于转录组测序获得一条黏虫UDP-葡萄糖基转移酶cDNA序列,经UGT国际命名委员会命名为UGT33J12(GenBank登录号:MT873954).该序列全长1798 bp,含有1个开放阅读框,长度为1557 bp,编码518个氨基酸组成的...     

华山新麦草蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因Ph-1-SST的克隆及序列分析

蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因1-SST在植物逆境胁迫反应中起重要作用。为了挖掘华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng)抗非生物胁迫关键功能基因,以华山新麦草叶片为材料,利用RT-PCR结合RACE技术克隆1-SST基因的全长cDNA,命名为Ph-1-SST,登录号为KX761897。通过PCR法扩增其gDNA序列,测序结果表明该基因的gDNA和cDNA序列长度分别为3 344bp和2 001bp,编码666个氨基酸残基,序列结构分析结果表明该基因含4个外显子3个内含子,预测该蛋白相对分子质量为72.9ku,理论等电点为4.87。序列比对显示,该基因与大麦1-SST基因编码蛋白的相似性最高(90%),为糖基水解酶32家族成员。对1-SST氨基酸序列的系统进化树分析显示,Ph-1-SST及其同源蛋白位于不同分支,初步推断此全长cDNA是华山新麦草中编码蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶的一个新基因。结果为作物非生物胁迫改良提供重要基因资源。     

茄子花青素糖基转移酶基因SmGT的克隆与生物信息学分析

葡萄糖基转移酶(SmGT)是植物花青素合成途径中的一种关键酶,在植物果实颜色调控方面具有重要的作用。试验以紫色茄子三月茄为材料,设计一对特异性引物,克隆SmGT基因的ORF(开放阅读框),获得长度为1 413 bp的全长序列。序列分析表明,SmGT肽链含有470个氨基酸,分子量为52.75 ku,等电点为4.98,是一种参与生物体代谢途径的亲水性多肽。结构域和三级结构分析均表明,SmGT含有典型的UDP-葡萄糖基转移酶结构域,是一种糖基转移酶。蛋白质相似性分析表明,SmGT蛋白与马铃薯、野生番茄、辣椒和矮牵牛的葡萄糖基转移酶相似性分别为93%、93%、91%和87%。SmGT基因的克隆对于研究茄子花青素的生物合成途径以及分子机理具有重要意义。     

菊花花瓣XTH基因cDNA序列的克隆与分析(英文)

[目的]为研究非乙烯敏感型菊科植物的木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶(xyloglucan endo-transglycosylase/hydrolase,XTH)基因的结构特征。[方法]采用Trizol方法从菊花花瓣中提取总RNA,利用RT-PCR技术和T/A载体克隆XTH基因的cDNA序列。[结果]测序结果表明,克隆的cDNA片段大小为911bp,编码293个氨基酸残基,具有XTH蛋白家族的7个活性位点,命名该基因序列为CmXTH(基因登录号为HM752243);其推导的氨基酸序列与其它19种植物的XTH具有较高的同源性,其中与非洲菊、蕃茄的亲缘关系最近,而与猕猴桃、草莓、胡杨等的亲缘关系较远。[结论]克隆片段确为XTH基因的cDNA序列,可能与菊花花瓣的生长与衰老过程有关。     

番茄γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆与分析

[目的]为进一步研究γ-生育酚甲基转移酶(TMT)基因的功能奠定基础。[方法]以拟南芥γ-TMT cDNA为信息探针,在GenBankdbEST数据库中搜索与其高度同源的番茄EST序列,通过人工序列拼接得到番茄γ-TMT的cDNA序列。据此拼接序列设计1对特异引物,以番茄叶片cDNA第1链产物为模板进行RT-PCR,回收目的片段,转化到大肠杆菌DH5α进行TA克隆。最后对获得的阳性克隆进行测序,分析测序结果与其他物种中该基因之间的同源性,进行氨基酸序列比对及系统进化分析。[结果]经RT-PCR扩增出1300bp左右的片段,成功克隆了番茄γ-TMT基因。克隆片段全长1354bp,包含1个1089bp的完整开放读码框,与拼接序列完全一致。番茄γ-TMT基因编码的氨基酸序列与马铃薯、小麦、玉米和拟南芥的γ-TMT基因的同源性分别达89%、75%、75%和70%。系统进化分析表明,番茄与马铃薯的γ-TMT基因有较近的亲缘关系。[结论]该试验中克隆的番茄γ-TMT基因编码的蛋白质分子量为39.8kD,等电点为8.28。     

烟草糖基转移酶sm-ngt1缺失体表达载体的构建及遗传转化

利用烟草糖基转移酶基因sm-ngt1序列的氨基端(N’-GT)和羧基端(C’-GT)的部分序列与双元载体pCAMBIA1302连接,构建了含有N’-GT、C’-GT的缺失片段与绿色荧光蛋白(GFP)的融合基因。通过农杆菌介导的叶盘转化法转化W38烟草,通过PCR检测发现含有目的片段的融合基因的转基因植株阳性率可达80%以上,为后续的基因功能研究奠定基础。     

烟草糖基转移酶基因NtGT3的克隆与生物信息学分析

为了给烟草糖基转移酶的生物学功能研究奠定基础,根据在GenBank上登录的烟草糖基转移酶基因NtGT3的CDS序列,以烟草栽培品种K326为材料,采用PCR的方法,对目的基因进行克隆,并测序。根据测序的结果,采用各类分析软件,对所获得的DNA片段进行生物信息学分析。结果通过PCR的方法,成功克隆了烟草糖基转移酶基因NtGT3的全长CDS序列。生物信息学分析结果表明,该基因CDS全长1 449 bp,所编码的蛋白质包含482个氨基酸。其分子量为54.15 ku,等电点为5.53。在二级结构上,α-螺旋和无规则卷曲为蛋白的主要结构形式。在三级结构上,具有42%的α-螺旋以及15%的β-折叠。NtGT3蛋白是一个亲水性蛋白质,含有2个糖基化位点,不含信号肽。NtGT3蛋白广泛分布于细胞中,在细胞膜、微体、高尔基体及内质网膜的分布分别达到了79%、31.9%、30%及20%。功能结构域分析结果证实,该蛋白包含有糖基转移酶家族的功能保守域PLN03015,属于GTB类型的糖基转移酶超级家族。同源性分析结果表明,NtGT3蛋白与枸杞、睡茄、甘薯、可可、猕猴桃、杨树、葡萄、野生大豆及拟南芥等的糖基转移酶有较高的序列相似性。NtGT3基因的成功克隆,为该基因功能的深入研究提供了理论支撑。     

一个烟草糖基转移酶启动子在转基因烟草植株中的表达分析（摘要）

[目的]研究从烟草中克隆的1个受水杨酸和茉莉酸甲酯诱导表达的新的糖基转移酶基因（sm-Ngt）启动子部分缺失片段在烟草中的表达。[方法]以转sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子与Gus基因融合植物表达载体的T1代转基因植株为材料,用茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）处理16h后分别进行GUS组织化学染色和荧光定量法测定GUS酶活性,分析水杨酸和茉莉酸甲酯对sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子表达的影响。[结果]在5个不同缺失片段启动子的转基因T1代生长30d的植株中,转-220～0bp片段的GUS染色最少,转-524～0bp及-468～0bp片段的染色最深。在没有MeJA和SA诱导处理时,-524～0bp和-468～0bp2个启动子片段启动的GUS活性最高,远高于-1150～0、-800～0、-220～0bp片段的活性,并且不是由于基因拷贝数而引起的（Southern杂交结果）;-800～0bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA和SA双重诱导,-1150～0bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA的诱导。[结论]在sm-Ngt启动子的-524～-220bp存在提高启动子活性调控元件,-1150～-524bp存在抑制启动子活性的序列,并且存在MeJA和SA双重诱导启动子活性调控元件。     

天然彩色棉纤维特异表达启动子LTP3的克隆及其在烟草中的表达特异性

报道天然彩色棉纤维特异表达启动子LTP3,大小为1 548 bp。经测序分析,与GenBank中登录的海岛棉（Gossypium hirutum L.DES119）特异表达启动子序列同源性为99%,仅有个别碱基发生改变,而启动子的基本元件未发生突变。将克隆的启动子与报告基因GUS融合,构建植物表达载体pBI-LTP3,...     

转截短hpalXoo基因烟草抗病防御酶活性分析

[目的]探讨转截短hpalXoo基因烟草中与抗病性有关的5种防御酶系的活性变化.[方法]以转截短hpalXoo基因烟草A6-1和对应的非转基因烟草Xanthi叶片为材料,接种烟草花叶病毒（TMV）,测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性.[结果]未接TMV时,转截短hpalXoo基因烟草中POD、PPO和CAT酶活性均高于未转基因对照品种,而SOD和PAL活性与未转基因烟草无显著差异.接种TMV后,转截短hpalXoo基因烟草中5种防御酶活性均显著增加,且高于未转基因烟草,并维持在一个较高的水平.[结论]截短的hpalXoo基因在烟草中表达能显著提高其抗病防御酶活性水平.     

烟草富含锚蛋白重复结构域基因Nbar的克隆及序列分析

根据1个已报道的马铃薯富含锚蛋白重复结构域基因Star的全长eDNA序列,分别在含有起始密码子和终止密码子处设计基因特异引物,从感染了晚疫病原菌的本氏烟草叶片cDNA中克隆得到1个新的基因Nbar。此基因包含1个最大为1539bp的阋读框,与Star的碱基一致性达到90％。该基因编码513个氨基酸,序列中存在6个锚蛋白重复结构域和1食环指结构域。Nbar已提交GenBank,登录号为1231763。     

红海榄液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆与分析

根据液泡膜Na+/H+反转运蛋白基因(fHXl)的保守序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到红海榄Na+/H+反转运蛋白基因的cDNA片段,然后采用cDNA末端快速扩增法(RACE)得到RsHX1基因的全长cDNA序列,GenBank登录号为FJ627273,被命名为RsNHXl.该基因序列的长度为2 094 bp,包...     

Tgf2转座子介导鲤Fst1基因元件在鲤中的转基因效率研究

卵泡抑素(follistatin,Fst)蛋白具有拮抗TGF-β超家族许多成员的功能,通过直接的蛋白结合可抑制肌肉抑制素(myostatin)的活性,从而恢复肌肉的生长,表现出增肌效应。参照鲤高通量转录组测序数据的拼接结果,筛选出鲤卵泡抑素Fst1基因的编码框(ORF)序列(全长1 260 bp,编码320个氨基酸),构建了包含金鱼Tgf2转座子左臂(220 bp)、右臂(185 bp)、斑马鱼Mylz2启动子和鲤Fst1基因ORF的供体质粒pTgf2-Mylz2-ccfst1。通过显微注射方法,并在体外合成的Tgf2转座酶5'加帽mRNA的介导下,获得了一批转鲤Fst1基因的转基因鲤。经PCR检测,转基因鲤Fst1外源基因的整合率平均为44.7%,对其中4尾转基因阳性鲤的扩增产物进行回收、克隆和测序验证,结果表明阳性鲤中均含有转基因目的片段。说明Tgf2转座子转基因系统可在鲤中实现较高的转座效率,为进一步研究卵泡抑素在鲤肌肉发育中的功能奠定了基础。     

甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)克隆及其在转基因烟草中的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)并分析其在转基因烟草植株中的表达特性,为研究CIN1基因功能提供参考.[方法]克隆SoCIN1基因,利用基因重组技术构建植物正义表达载体pBI121-SoCIN1,采用叶盘法经农杆菌EHA105介导将其转化烟草品种K346.经抗性筛选和PCR扩增验证后获得转SoCIN1基因烟草植株,采用半定量PCR检测叶片SoCIN1基因的表达量,并测定叶片可溶性糖含量、CIN活性及株高(以野生型烟草为对照).[结果]克隆获得的SoCIN1基因长度为1731 bp,与GenBank已公布的SoCIN1基因(JQ312298)核苷酸序列同源性达100%,并通过构建其植物正义表达载体转化烟草.PCR扩增鉴定结果表明,SoCIN1基因已整合至烟草基因组DNA.对F0和F1代进行转基因烟草连续筛选,获得4个转SoCIN1基因烟草株系(T-1、T-2、T-3和T-4).在4个株系的叶片中均检测到SoCIN1基因的表达,其中以在T-1株系叶片中SoCIN1基因表达量最高,其次是T-3株系,最低的是T-4株系.4个株系叶片的可溶性糖含量、CIN活性及株高均高于野生型烟草,其中CIN活性显著高于野生型烟草(P<0.05,下同),且T-1株系CIN活性高于其他3株系;T-1、T-2和T-3株系叶片可溶性糖含量分别显著高于野生型烟草39.68%、19.95%和31.15%;T-1、T-2、T-3和T-4株系的株高较野生型烟草分别提高了15.57%、2.90%、5.74%和5.22%,但仅T-1株系与野生型烟草存在极显著差异(P<0.01).[结论]转SoCIN1基因烟草叶片过表达SoCIN1基因,能提高烟草的CIN活性和可溶性糖含量,促进植株生长,由此推测该基因在甘蔗生长发育和蔗糖积累过程发挥作用.     

烟草高亲和钾转运蛋白基因NtHAK5克隆及表达模式分析

【目的】克隆烟草高亲和钾转运蛋白基因（NtHAK5）,并分析其在不同非生物胁迫下的表达模式,为深入探究该基因在烟草抵御低钾胁迫等非生物胁迫中的功能和作用机制提供理论参考。【方法】从普通烟草K326中扩增NtHAK5基因编码区（CDS）序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并构建pBWA (V) HS-NtHAK5-GLosgfp融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白的亚细胞定位情况。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测NtHAK5基因在不同组织和不同非生物胁迫条件下的表达特性,以无胁迫处理（正常供钾2 mmol/L K+）的植株为对照（CK）。【结果】烟草NtHAK5基因CDS序列全长2418 bp,共编码805个氨基酸残基,其编码蛋白的分子量为89874.00 Da,理论等电点（pI）为8.65,属于稳定性疏水蛋白,含有HAK家族蛋白典型的跨膜结构域。NtHAK5基因的二级结构中α-螺旋占40.12%,延伸链占24.97%,无规则卷曲占26.21%,β-折叠占8.70%。NtHAK5蛋白与烟草NtHAK1和黄花烟草NrHAK1蛋白的氨基酸相似性分别为40.69%和40.44%,与拟南芥AtHAK5相似性最高,为58.26%。NtHAK5基因启动子含有厌氧、低温、干旱、脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）响应的相关顺式作用元件。NtHAK5蛋白定位在细胞膜上。低钾胁迫处理下和正常供钾（CK）条件下,NtHAK5基因在根、茎、老叶和新叶中均有表达,且均以老叶中相对表达量最高。NtHAK5基因在干旱胁迫、冷害处理、盐胁迫和低钾胁迫下的相对表达量显著高于CK （P<0.05）,但在低氮和低磷条件下的相对表达量与CK无显著差异（P>0.05）。【结论】 NtHAK5基因属于HAK基因家族成员,具有明显组织表达特异性,参与烟草植株对干旱胁迫、冷害胁迫、盐胁迫和低钾胁迫等非生物胁迫响应,推测其编码的蛋白在烟草组织中作为K+转运体参与非生物胁迫下K+的吸收、转运和再利用。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SotSPSB的克隆及原核表达

【目的】克隆甘蔗B家族s0心PsB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue－2上导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米（Zeamays）ZmSPS1和水稻（Oryzasativa）OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因（SolSPSB）2330bp序列。结合5’－RACE和3’－RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框（0I江）;起始密码子（ATG）位于转录起始位点后56bp处,终止密码子（TGA）后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm—SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94．7％和81．3％,氨基酸序列同源性分别为96．0％和83．9％;其理论分子量Mw=118．96kDa,等电点pI=6．30。经原核表达后纯化获得带6xHis标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sol-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SoPSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。     

山核桃APETALA1同源基因的克隆与序列分析

根据植物花分生组织及花器官形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的高度保守区序列,设计合成一对长度为23bp的聚合酶链式反应（PCR）引物,以山核桃Carya cathayensis因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长为486bp的DNA片段,克隆到pMD18-T载体。测序和序列分析结果表明,获得了山核桃AP1同源基因中的1个片段,该片段序列包含2个内含子,长度分别为86bp和291bp,编码区共编码36个氨基酸。其序列已在Gen荷Bank中注册（注册号为EU155118）,在Gen Bank中进行同源性检索结果表明,其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达69％～88％,推测它们在功能上也是相似的。