哺乳动物体细胞核移植技术的应用价值

1997年成年体细胞核移植绵羊“多莉”的诞生,标志着动物体细胞克隆时代的到来。哺乳动物体细胞核移植技术从此受到了人们的广泛关注,应用该方法,各国学者相继生产出了体细胞克隆绵羊、牛、小鼠、山羊、猪、猫、兔、骡、马和大鼠等多种哺乳动物。那么该技术的应用价值究竟体现在哪些方面呢?一、在生命科学的基础研究领域该技术打破了生命科学中动物已分化细胞不具有发育全能性的传统概念,改写了部分生物学基础理论;为研究受精卵与早期胚胎核、质相互作用提供了新的方法;为研究哺乳动物细胞分化机制、细胞衰老和分化机理提供了新的手段;为基因…     

猪体细胞核移植技术及研究现状

自2000年Polejaeva I A获得第1头克隆猪后,短短几年时间全世界已有10多例成功的报道,使得猪的体细胞核移植有了长足的发展,但目前猪的体细胞核移植效率依然低下,人们对核移植中重编程分子机理的认识知之甚少。简要综述了猪体细胞核移植近年来的研究进展,分析了猪核移植中的技术难点和影响因素。     

利用多态微卫星标记进行体细胞核移植山羊的遗传鉴定

微卫星广泛用于体细胞核移植动物的遗传同一性鉴定.本研究选取36个微卫星位点, 首先以2只无亲缘关系的鲁北白山羊个体对这些位点进行PCR扩增和多态性分析,筛选出10个高度多态的位点;然后对3只体细胞核移植山羊进行各位点的基因型分析.结果表明,每只核移植山羊与其供核细胞的基因型完全相同,而与受体母羊的基因型在多数位点上均不同 (克隆羊C1、C2和F与其受体母羊的基因型在10个位点中分别有9、10和10个位点不同), 证明这3只体细胞核移植山羊均由体细胞克隆而来,与受体母羊无遗传关系.     

体细胞克隆牛生产效率的影响因素

体细胞克隆牛生产效率受实验室环节和胚胎移植环节等多种因素的影响。依据前期试验结果,重点分析了胚胎移植数量、季节变化和胚胎移植受体牛生理状态等因素对体细胞克隆牛生产效率的影响。结果表明:移植2枚胚胎比移植1枚胚胎和3枚胚胎能获得较高的妊娠率和产犊率及较低的流产率;在春、夏和秋季(5~9月)进行胚胎移植的效果显著优于冬季(12~1月);A、B级黄体受体牛的妊娠率显著高于C级黄体受体牛的妊娠率。胚胎移植数量、移植季节和受体牛生理状况均能显著影响克隆牛的生产效率。     

体细胞核移植克隆牛的遗传物质鉴定

应用活体取卵(OPU)技术采集遗传背景清晰的卵母细胞作为受体细胞,与不同来源的供体细胞核进行体细胞核移植(SCNT)。通过微卫星DNA及线粒体DNA检测,分别对5头克隆牛核内和核外DNA进行了分析。结果表明克隆牛的微卫星DNA与核供体牛完全一致,而线粒体DNA则全部来源于卵母细胞。     

广西巴马小型猪体细胞核移植体系的建立

通过建立广西巴马小型猪体细胞核移植培养体系,为后续转基因克隆猪生产及其相关研究提供最佳条件.试验探讨了盲吸法对猪卵母细胞的去核效率;利用分离到的广西巴马小型猪附睾成纤维细胞作供体构建重构胚胎,探讨6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)和细胞松弛素B(CB)对其后续胚胎发育的影响;利用分离到的广西巴马小型猪腹部成纤维作供体,探讨其对核移植胚胎的发育效率.结果表明:猪卵母细胞盲吸法去核的效率为73.75％;广西巴马小型猪附睾成纤维细胞作供体构建重构胚胎,6-DMAP和CB对其后续胚胎发育没有显著差异(分裂率和囊胚率分别为:89.89％and 6.74％vs.82.95％and 5.68％,P＞0.05);腹部成纤维细胞作供体,重构胚胎的融合率、分裂率和囊胚率分别为55.40％、67.53％和6.49％.采用盲吸法可以对体外成熟猪卵母细胞成功去核,广西巴马小型猪腹部成纤维细胞和附睾成纤维细胞均可作供体成功构建体细胞核移植胚胎,并可以发育到囊胚.     

猪体细胞核移植电融合参数的研究

试验旨在研究不同电融合参数(场强、脉冲时程)对猪核移植胚融合率及发育能力的影响。采用44～48h成熟培养的去核猪卵母细胞作为受体细胞,颗粒细胞为供体。结果表明,在20μs脉冲时程条件下,0.8kV·cm-1组融合率显著高于0.4、1.2、1.6kV·cm-1组(P0.05)。0.8、1.2kV·cm-1组卵裂率显著高于0.4、1.6kV·cm-1组(P0.05)。场强为0.8kV·cm-1条件下,20μs组融合率显著高于30、40、50μs组(P0.05)。卵裂率20、30μs组显著高于40、50μs组。根据试验数据,本试验室最佳融合电参数为:0.8kV·cm-1、20μs,1次脉冲。     

合理利用种公猪

初配年龄，一般适宜年龄为培育品种8～9个月龄．体重100公斤左右；北方地方猪种8个月龄．体重80公斤左右。种公猪的利用强度．本交时．1～2岁的青年公猪高强度利用可每天配种1～2次，如1天配2次．     

种公猪的饲养管理技术

种公猪管理的主要目标是提高种公猪的配种能力,使种公猪体质结实,体况不肥不瘦,精力充沛,保持旺盛的性欲,精液品质良好,提高配种受胎率.     

种公猪的饲养管理

一、饲养要求 1．体质健壮 种公猪的体质健壮程度反应在种公猪的精力是否充沛，体况是否符合种用的要求。种用公猪应具有中上体况，四肢健壮，肌肉明显。     

体细胞克隆猪繁殖性能及后代生长性能评估

本文旨在探讨克隆种猪与供体猪在繁殖和遗传性能的关系,评估体细胞克隆公猪在保存优良基因和商品猪生产中的应用。克隆皮杜公猪,检测其精液质量相关指标,比较克隆公猪、供体公猪与配母猪的窝产总仔、活仔数等指标,并对两者后代进行生长性能测定。结果表明,与供体猪相比,克隆猪及后代在各项检测指标中均无显著差异,说明克隆猪具有正常的繁殖性能,且保留了供体优秀的遗传性能,可以作为优秀种公猪进行生产应用。     

Factors influencing the somatic cell nuclear transfer efficiency in pigs

Using a data set from our laboratory, we assessed the effects of several factors on pig cloning efficiency. The results demonstrated that cells at high confluence (>90%) used as donor cell resulted in higher pregnancy rate, delivery rate and overall cloning efficiency (number of live offspring born per reconstructed embryo transferred to recipients) compared with the cells at 60% to 79% confluence and 80% to 89% confluence. Cells with four, five and six passages compromised the pregnancy and delivery rates compared with first passage cells. The number of blastocysts transferred by somatic cell nuclear transfer (SCNT) did not significantly affect the cloning efficiency, but transfer of blastocyst derived from in vitro culture 5 d after SCNT achieved a significantly higher pregnancy rate compared with one to two cell SCNT embryos from overnight culture. The highest pregnancy rate, delivery rate and the largest litter size were obtained when Bama Miniature pig fibroblasts were used as donor cells and Landrace/Yorkshire hybrid gilts were used as recipients. Recipients treated with chemicals for estrus synchronization had higher pregnancy rates compared with untreated recipients. Our data might be helpful for improving SCNT efficiency in pigs.     

Production of homeobox A10 gene transgenic pigs by somatic cell nuclear transfer

Homeobox A10(Hoxa10) gene is one of the most important candidate genes associated with the reproductive performance of humans and mice. Overexpression of Hoxa10 in mouse endometrium can increase litter size. Moreover, Hoxa10 plays a key role in regulating the embryo implantation of sows. This study aimed to generate transgenic pigs using Hoxa10 via somatic cell nuclear transfer(SCNT). We established seven Hoxa10-transgenic cell lines, and two of the cell lines were selected as nuclear donors for the transfer. A total of 1 270 cloned embryos were generated and transferred to five surrogate mothers(Landrace×Yorkshire). Eight cloned male piglets were produced including one with cryptorchidism. Six transgenic piglets grew up healthy and produced 56 offspring. Finally, we obtained six transgenic male pigs and 26 transgenic positive offspring that can be used to further study the regulatory mechanism of Hoxa10 on the reproductive performance of pigs.     

PD0325901和CHIR99021促进牛体细胞克隆胚胎体外发育的研究

【目的】选取MAP2K和GSK3的抑制剂PD0325901、CHIR99021(简称2i)对牛体细胞核移植(SCNT)胚胎进行处理,研究这2种小分子物质对胚胎发育及其多能性基因(OCT4、SOX2、KLF4、DPPA3、CDX2、GATA4、NANOG)表达的影响。【方法】以牛皮肤成纤维细胞为供体,牛MⅡ期卵母细胞为受体,构建牛SCNT胚胎,采用添加2i(PD0325901 0.4μmol/L,CHIR99021 3μmol/L)的胚胎培养液体外培养SCNT胚胎72h,以mSOF+DMSO培养液处理的SCNT胚胎及体外受精(IVF)胚胎为对照,统计核移植胚胎体外发育率,并对胚胎多能性相关基因的表达进行实时定量PCR检测。【结果】与对照相比,2i处理能使SCNT胚胎囊胚率和囊胚细胞总数显著增加,凋亡细胞率显著下降,多能性相关基因NANOG和SOX2表达量上调,而细胞分化相关基因GATA4的表达量下调,其他基因表达量变化不显著,从而使SCNT胚胎的发育状态更接近于IVF胚胎。【结论】2i共处理72h可优化SCNT胚胎发育状态。     

供体细胞来源及预处理对牛体细胞核移植效率的影响

以牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体细胞,比较了不同同步化诱导方式(血清饥饿法与接触抑制法)、供体细胞冷冻与否、供体动物性别与年龄等因素对体细胞核移植效率的影响。结果表明,接触抑制法处理的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于饥饿法(P<0.05);未冷冻的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于冷冻供体细胞(P<0.05);成年母牛供体的囊胚率显著高于成年公牛(P<0.05);不同年龄供体细胞的核移植胚囊胚率差异不显著(P>0.05)。试验表明,以接触抑制法诱导未冷冻成年母牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体,有利于核移植胚囊胚的发育。     

成年克隆猪与正常繁殖猪心脏的比较蛋白质组学研究

【目的】探讨体细胞核移植(即克隆)操作对克隆猪心脏发育的影响。【方法】分别对3头正常繁殖猪和3头成年克隆猪的心脏进行解剖学观察和组织切片分析。提取心脏蛋白样品,利用基于双向电泳-质谱体系的比较蛋白质组学技术对心脏蛋白进行分析。【结果】解剖学观察和组织切片分析证实,克隆猪心脏发育异常;与正常繁殖猪相比,克隆猪心脏蛋白共有6种差异表达蛋白,分别为组织蛋白酶-D、骨骼肌型α-肌动蛋白、心肌肌球蛋白重链、热休克蛋白-27、Telethonin和骨骼肌型α-肌动蛋白,其中前5种蛋白表达上调,后1种蛋白表达下调。【结论】一些重要的心脏蛋白表达异常可能导致了克隆猪的心脏发育缺陷,比较蛋白质组学手段可以作为探索体细胞核移植机制的重要方法。     

TSA浓度及处理时间对猪体细胞核移植胚胎体外发育影响

曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂.有研究表明TSA处理可以提高核移植胚胎的发育率.为探讨TSA对猪核移植胚胎发育的作用,试验重点研究了TSA浓度及处理时间对核移植胚胎体外发育的影响,同时也探索了TSA对不同供核细胞构建的重构胚体外发育的影响.结果表明,40 nmol·L-...     

绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚的构建及体外发育研究

【目的】以绵羊卵母细胞为受体,构建绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚,比较其体外发育能力,探讨绵羊卵母细胞对异种体细胞核的再程序化能力。【方法】以体外成熟的绵羊卵母细胞为核受体,分别以绵羊及山羊胎儿成纤维细胞为核供体,经卵母细胞去核、注核、重构胚电融合、激活等一系列操作,构建同种绵羊-绵羊及异种山羊-绵羊体细胞的克隆胚,比较其体外发育能力。【结果】同种间克隆胚的囊胚发育率(16.0%)高于异种间克隆胚(7.4%)。异种间克隆胚在8-细胞到16-细胞及16-细胞到桑椹胚期间的发育能力显著低于同种间克隆胚。2种克隆胚在2-细胞到8-细胞期间的发育速度基本相同,但异种间克隆胚在8-细胞到囊胚期间的发育速度明显低于同种间克隆胚,两者相差12~24 h。【结论】绵羊卵母细胞对异种体细胞核具有再程序化能力,但这种再程序化能力明显低于其对同种体细胞核的再程序化能力。     

波尔-黄淮白山羊体细胞核移植重构胚电融合参数的选择

以波尔山羊耳成纤维细胞为核供体细胞,黄淮白山羊卵母细胞为受体进行核移植,对重构卵进行电融合处理,发现电融合参数为250 V·mm-1、1次电脉冲时,40μs组的卵裂率显著高于10 μs组和20μs组(P＜0.05),但10μs组融合后的存活率最高(P＜0.05).当融合参数为250 V·mm-1、10μs时,2次电脉冲组的卵裂率显著高于1次电脉冲组(P＜0.05),但1次电脉冲组的融合后存活率和胚胎获得率均高于2次脉冲组(P＜0.05).综合试验结果认为,适宜的山羊体细胞核移植的电融合参数是250 V·mm-1、10μs、1次电脉冲.