中国台湾番茄曲叶病毒侵染引起广东番茄黄化曲叶病

广东汕头番茄(Lycopersicon eseulentum)上发生的黄化曲叶病毒病,田间症状表现为病株明显矮化、病叶褪绿黄化、叶小且卷曲和叶质较脆硬。对该病毒代表分离物(BS)基因组DNA-A克隆和测定结果表明,其全长为2740nt(GenBank acces-sion No.DQ237918),具有菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒基因组典型特征,为闭合环状单链DNA,有6个ORFs,分别位于病毒链上的AV1、AV2及位于互补链上的AC1、AC2、AC3和AC4;在基因AV2与AC1之间有269nt的非编码区。BLAST结果显示,BSDNA-A与Begomovirus中来自亚洲的病毒同源性较高,而与美洲、非洲等地的相对较低;其中与中国台湾番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus,ToLCTWV)DNA-A全序列同源性最高,为97.7%,而二者的AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4基因及IR的同源性分别为98.6%、98.0%、98.0%、97.5%、96.3%、98.6%和96.6%,推导编码的6个蛋白的氨基酸序列同源性分别为97.7%、99.1%、97.5%、95.6%、91.8%和99.0%%。全序列系统进化关系树显示,BS与ToLCTWV的亲缘关系最近,并形成一个独立分支,再与广东番茄曲叶病毒G2(Tomato leaf curl Guangdong virus G2,ToLCGDV-[G2]和广东番茄曲叶病毒G3(Tomato leaf curl Guangdong virus G3,ToLCGDV-[G3]形成一个大的分支,而与其它33种Begomovirus病毒的亲缘关系均相对较远。这些结果表明,BS应是ToLCTWV的一个分离物。     

分离自陕西泾阳番茄的番茄黄化曲叶病毒(TYLCD)的分子特征

从陕西泾阳地区的番茄(Lycopersicon esculentum)上采集到73份表现矮化、黄化和曲叶症状的番茄黄化曲叶病(Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)样品,利用双生病毒简并引物PA和PB及番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的通用引物TYT-F和TYT-R进行PCR扩增,共有70个样品检测呈阳性;利用双生病毒DNA-B及卫星DNA的通用引物,未扩增到相应目标条带;随机选取样品SX8,利用滚环扩增PCR(RCA-PCR)、克隆及测序等技术获得病毒DNA-A的全基因组序列,该DNA分子全长含2781bp(GenBank登录号:JN412854),与来自山东番茄的TYLCV分离物SD2(缩写为TYLCV-[SD2])(GenBank登录号:GU199587)的核苷酸序列相似性最高,为99.9%;系统进化分析发现,该病毒分离物与我国已报道的TYLCV各分离物亲缘关系较近。这些结果表明,陕西番茄黄化曲叶病是由TYLCV引起,该病毒可能来源于我国山东番茄上的TYLCV。     

RNA沉默介导的转基因烟草抗中国番茄黄化曲叶病毒研究

近年来,中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)病在我国自南向北不断蔓延,发病地块减产甚至绝产,造成了巨大的经济损失.本研究应用RNA沉默(RNA silencing)防治病毒病原理构建TYLCCNV外壳蛋白(coat protein,CP)部分基因片段dsRNA(double-strand RNA)导入本氏烟(Nicotiana benthamiana)获得了抗TYLCCNV的转基因烟草.实验结果表明,目的基因已整合到转基因烟草植株的基因组中.用TYLCCNV侵染性克隆接种转基因烟草,症状观察和PCR检测发现,对TYLCCNV表现为免疫的转基因烟草占14.6％.Northern blot分析表明,在不同的抗病类型转基因植株中,目的基因mRNA的积累量存在明显的差异,其积累量与抗病型呈负相关.研究结果对利用RNA沉默防治TYLCCNV有一定的理论指导意义.     

番茄黄化曲叶病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立

以纯化的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)外壳蛋白为抗原,免疫家兔制备并纯化出TYLCV的多克隆抗体IgG,以此抗体做包被抗体,并用碱性磷酸酶(AP)对其进行标记作为酶标抗体,从而建立了番茄黄化曲叶病毒的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法。通过ELISA方阵试验确定该法的最佳工作浓度为酶标抗体(IgG-AP)作1∶400倍稀释,包被抗体浓度为6.25μg.mL-1;并且确定了抗原最低检出浓度为9.75ng.mL-1。采用该法对山东寿光的田间病样进行了定性和定量检测,结果表明建立的DAS-ELISA方法灵敏度高、特异性强,可用于番茄黄化曲叶病毒的常规检测。     

上海地区番茄黄化曲叶病毒病的鉴定及嫁接接种法研究

番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）是一种由烟粉虱（Bemisia tabaei）和嫁接传播的双生病毒,在热带、亚热带地区给番茄生产造成严重威胁。根据番茄黄化曲叶病毒的保守序列设计一对引物,运用PCR技术从上海地区的感病番茄中扩增出一条575bp的特异带,而健康植株无此带。测序表明该序列与番茄黄化曲叶病毒具有极高的同源性（97％～99％）。将健康接穗嫁接到感染番茄黄化曲叶病毒的番茄砧木上,间隔15d和30d,分别提取接穗的DNA,并用PCR法检测病毒,发现嫁接15d后在部分接穗中检测到TYLCV病毒,嫁接30d后在所有的接穗中均检测到病毒,因此,嫁接法可以作为番茄黄化曲叶病毒病的接种鉴定方法。     

RNA干扰V1和C1提高番茄植株对番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的抗性

为了获得高抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)番茄材料,本研究通过人工设计以TYLCV病毒基因V1、C1为靶标的双链RNA(dsRNA),通过农杆菌介导法转化番茄,探索RNAi技术在番茄抗TYLCV中的防御效果。结果表明,通过RNAi技术干扰TYLCVV1和C1基因可以延缓病毒症状的发生,提高番茄植株对TYLCV的抗性。田间试验结果发现,以TYLCV V1和C1为靶标的RNAi株系RNAi-CP-2和RNAi-Rep-12,不仅可以干扰病毒V1、C1的表达,而且可以干扰TYLCV其他4个基因V2、C2、C3和C4,表明RNAi技术可以在靶标基因附近传递,影响相邻其他基因的表达。本研究结果为番茄抗病毒研究奠定了理论基础。     

侵染云南白肋烟的中国番茄黄化曲叶病毒及伴随卫星DNA分子的基因组特征*

从中国云南省大理地区表现曲叶症状的白肋烟(Nicotina tabacum White Burley)上分离到病毒分离物Y43,该病毒可经烟粉虱(Bemisia tabaci)及嫁接传播。用15种粉虱传双生病毒的单抗对病样进行TAS-ELISA检测,结果表明,该病毒属菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒。对DNA-A1.7kb基因组序列测定和分析表明,Y43与中国广西报道的中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato ycllow lcafcurl China virus,TYLCCNV)同源性达89％,其中外壳蛋白(CP)氨基酸同源性达96％,因此Y43应为TYLCCNV的一个新分离物。进一步研究发现,Y43还伴随着一个长l349nt的卫星DNA分子(DNAβ)。Y43 DNAβ与AYVV DNAβ、BYVMV DNAβ和CLCuV DNAβ的同源性较低,而与中国分离的烟草曲叶病毒Y5 DNAβ和Y8 DNAβ的亲缘关系较近。DNAβ可能编码7个分子量超过3．5kD的ORF,其中Cl推测为有功能的ORF。     

从烟草上分离的中国番茄曲叶病毒及其卫星DNA全基因组结构特征

本研究从具有典型曲叶病症状的广西靖西烟草病植株上分离到病毒分离物JX-2,全基因组序列测定结果表明,JX-2DNA．A全长2738个核苷酸,共编码6个开放阅读框架（openreadingframes,ORFs）,其中病毒链编码AV1（CP）和AV2两个ORFs,互补链编码AC1、AC2、AC3和AC4共4个ORFs。BLAST结果表明,JX-2DNA—A与中国番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Chinavirus,ToLCCNV）各分离物的相似性在93．0％-99．7％之间,其中与ToLCCNV广西番茄分离物ToLCCNV．G32的相似性最高,达99．7％,而与其它双生病毒的同源性均在88．0％以下,表明Jx-2是ToLCCNV的一个分离物。基于Jx-2和已报道的双生病毒属代表种DNA-A全基因组核苷酸序列构建的系统进化树显示,JX-2与ToLCCNV-G32分离物的亲缘关系最近,并与ToLCCNV其它分离物形成一个分支,而与其它10种双生病毒的亲缘关系均相对较远。利用双生病毒卫星DNAβ的特异性引物β01／β02在Jx-2样品中扩增到DNAβ分子（JX-2β）,全长为1341个核苷酸,其互补链编码1个ORF（即βC1）,并包含一个富含A序列和一个卫星病毒保守序列。序列分析表明,JX-2β与ToLCCNV伴随的DNAβ的相似性在91．0％～96．1％之间,其中与ToLCCNV-G61DNAβ和ToLCCNV—G18DNAβ的相似性最高（96．1％）,与其它卫星DNAβ的相似性均低于61．8％。基于JX-2β全基因组核苷酸序列构建的系统进化关系树显示,JX-29与ToLCCNVG61分离物伴随的DNAβ亲缘关系最近,并形成一个独立的分支,再与ToLCCNV其余两个分离物伴随的DNAβ形成一个较大的分支。这是首次报道从烟草中分离到的中国番茄曲叶病毒及其伴随卫星DNA分子的全基因组结构特征。     

番茄钙依赖性蛋白激酶基因LeCPK2在热（光）胁迫中的功能鉴定

钙依赖性蛋白激酶（calcium—dependent protein kinases,CDPKsorCPKs）作为一类钙感知蛋白在植物的生长发育和胁迫应答中起着重要的作用。LeCPK2（Gen Bankaccession No．：GQ205414）是我们从番茄中分离的第3个CDPK基因,前期研究表明LeCPK2可能在植物热胁迫应答中发挥作用。为了进一步研究其在热胁迫中的功能,我们通过电子克隆的方法分离了LeCPK2的启动子序列,并通过LeCPK2过表达烟草分析其在高温胁迫中的潜在的功能。生物信息学分析显示,LeCPK2启动子中包含5个热响应元件,和前期试验结果一致。野生型植株在受到热胁迫后,对光更为敏感,强光照下植株叶片发生萎蔫,而强光本身不会对未受热胁迫的健康植株造成伤害。LeCPK2转基因植株热、光胁迫后不会出现受害表型。以上研究表明,LeCPK2在植物的热胁迫应答中发挥重要作用,能够有效保护植株免受高温胁迫的损害,是一个优秀的耐热（光）基因。本研究将为揭示番茄LeCPK2遗传功能及对其开发利用奠定基础。     

VIGS沉默番茄SlDCL2和SlDCL4破坏Ty-1/Ty-3对TYLCV的抗性

番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)严重威胁茄科蔬菜作物的生产。抗性标记Ty-1和Ty-3是一对等位基因,在番茄抗TYLCV育种中应用较为广泛。为了探究Ty-1/Ty-3抗病毒分子机制,本研究以携带Ty-1/Ty-3抗性标记的番茄Y19为材料,利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术,沉默RNA干扰(RNAi)机制关键基因,即番茄核糖核酸内切酶编码基因2a/b/c/d(SlDCL2)和番茄核糖核酸内切酶编码基因4(SlDCL4),初步分析其在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中的功能。PCR与测序结果发现SlDCL2、SlDCL4的VIGS沉默载体pTRV2∶SlDCL2和pTRV2∶SlDCL4构建成功。以沉默番茄八氢番茄红素脱氢酶(SlPDS)基因为标记植株,定量PCR检测SlDCL2、SlDCL4沉默株系中SlDCL2、SlDCL4基因的沉默效率,结果显示SlDCL2、SlDCL4沉默株系中对应基因的表达均小于对照植株的50%,表明SlDCL2、SlDCL4沉默载体确实可以降低对应基因的表达,且不影响其他DCL基因的表达。VIGS沉默植株SlDCL2、SlDCL4基因后接种TYLCV,接种TYLCV 30dpi结果显示,Y9材料表现出明显的TYLCV病毒症状,通过比较植株发病严重度发现,SlDCL2、SlDCL4沉默株系发病严重度分别为1.97、2.35,显著高于空载体注射株系(0.14)和对照株系(0.07)。本研究结果表明RNAi通路关键基因SlDCL2、SlDCL4在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中发挥着重要作用,这为利用Ty-1/3抗性标记基因育种奠定了基础。     

3种大蒜中洋葱黄矮病毒的RT-PCR分子鉴定

洋葱黄矮病毒（Onion yellow dwarf virus,OYDV）是危害大蒜产量和品质的主要病毒之一。快速有效的病毒检测方法可为大蒜病毒病的研究和有效防御提供理论与技术资料。本研究利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对甘肃＂成县迟蒜＂和山东＂鲁蒜王2号＂中OYDV外壳蛋白基因进行特异性扩增,并克隆到载体PMD18-TEasy Vector上进行核苷酸序列测定及分析。成功分离得到OYDV的两个DNA片段——GSCCS和SDLSW2,与GenBank中已报道的AB000837.1、AB000838.1和AJ409311.1等22个OYDV DNA片段的核苷酸相似性分别为81%～98%和81%～84%,氨基酸相似性分别为85%～99%和89%～94%,二者之间核苷酸相似性为84%,氨基酸相似性为89%。系统进化树显示不同DNA片段可聚为3个组群,GSCCS与中国山东金乡OYDV DNA片段同属一组,SDLSW2与其它16个OYDV DNA片段同属一组,表明OYDV在甘肃＂成县迟蒜＂和山东＂鲁蒜王2号＂中均存在,但具有一定差异。本实验确定了OYDV的基因变异程度,为进一步研究病毒进化和变异提供了有利条件。     

不同水分胁迫条件下温室番茄茎流和叶片水势的反应

以番茄"金粉2号"(Jingfen 2)品种为试材,设正常灌溉(T1)、轻度胁迫(T2)和重度胁迫(T3)3个土壤水分处理,观测不同土壤水分条件下番茄植株的茎流速率和叶片水势。结果表明,番茄植株茎流速率日变化呈现明显的规律性,晴天,T1和T2的番茄茎流速率呈明显的双峰曲线,中午12:00左右气孔关闭,茎流速率出现低谷。阴天,T1和T2处理番茄茎流日变化趋势总体较为平缓。不同水分处理下番茄的蒸腾量差异明显,水分胁迫处理的番茄蒸腾量均小于正常灌溉,土壤水分胁迫程度越严重,日蒸腾量越低。随着水分处理天数的增加,不同灌溉处理番茄的蒸腾量差异逐渐缩小。叶片水势随灌溉后天数增加而逐渐减少,叶片水势T1>T2>T3。相关分析表明,影响番茄茎流的主要气象因子为太阳辐射、空气温度和空气湿度。研究认为,番茄茎流与太阳辐射、空气温度和土壤水分呈正相关,叶片水势与空气相对湿度呈负相关。研究结果可为设施番茄水分管理提供科学依据。     

Characterization and Selection of Balanced Sources of Variability for Breeding Tomato (Lycopersicon) Internal Quality

Tomato breeders have hitherto selected for yield, uniformity and disease resistance rather than for internal qualities such as taste that depend on appropriate amounts and proportions of many different constituents. In order to improve internal quality it is necessary to find balanced donor parents with high contents of these individual constituents in order to develop this strategy. A methodology to evaluate all constituents together is also necessary. This work characterizes and classifies accessions of Lycopersicon to assist the selection of parents for several internal qualities. Thirty-eight accessions of L. esculentum, L. pimpinellifolium, L. hirsutum, L. pennellii and L. peruvianum have been studied, and their taste and vitamin C content characteristics have been measured. Some of the variables studied are complex since many chemical constituents are involved (pH, °Brix (SSC), titratable acidity), whereas other variables are individual constituents (vitamin C, oxalic acid, malic acid, citric acid, fructose, glucose and sucrose). Therefore, individual taste components in Lycopersicon accessions have been analysed by using precise analytical techniques (capillary zone electrophoresis) and statistical methods (principal component, cluster and GGE biplot analyses) for comparisons to be made not only among these, but also among controls (four breeding lines and one commercial hybrid). All analyses performed have allowed both for a good classification and for a selection of materials to be made. Two L. pimpinellifolium accessions are very interesting to use as donor parents in the first steps of tomato taste breeding programmes, since they are balanced and have shown three times the taste intensity of controls. Furthermore, characterization by individual constituents (citric, malic, oxalic and ascorbic acids, glucose, fructose, sucrose, etc.) has been found to be a precise tool to classify and select Lycopersicon germplasm for internal quality attributes.     

小麦叶片水分及绿度特征的光谱法诊断

通过ASD FieldSpec光谱仪测定2个小麦品种3个氮肥处理、3个水分处理下的叶片反射光谱,用SPAD-502仪测定叶片的SPAD(绿度指数)值,并称取叶重。用ViewSpec Pro与Matlab软件处理光谱数据,分析光谱参数与叶片含水量及SPAD值的相关关系,从而明确叶片水分及绿度特征的最佳波段或光谱指数。结果表明,水分指数(WI)、水分胁迫指数(MSI)及中红外植被指数(MSVI1)与叶片含水量的相关关系密切且表现稳定,均通过了0.05水平的显著性检验;Fd664(664nm附近处一阶导数光谱值)、SDr/SDb(红边区域一阶微分总和与蓝边区域一阶微分总和的比值)与小麦叶片SPAD值的相关性达到极显著水平,因而利用光谱法诊断和监测小麦叶片水分及绿度特征具有良好的可行性,可为遥感技术应用于精准农业提供依据。     

农杆菌介导的玉米遗传转化研究进展

农杆菌介导的转基因法是目前玉米遗传转化的主流方法之一。目前,模式玉米种质幼胚的转化体系已程式化,且开发了新筛选基因和获得不含筛选基因转基因玉米的方法,但是大多数育种骨干自交系转化频率低和转化受体基本上是幼胚。从农杆菌、受体及培养条件多方面各种因素对问题进行分析,多数研究认为针对特定基因型和受体材料建立好的受体再生系统,结合高效率农杆菌转化体系,获得多目的基因聚合（无其它外源片段）的转基因玉米将是农杆菌介导玉米转化体系研究的最终目标。本文主要从农杆菌介导（转基因）法应用于玉米遗传转化的历史、现状、问题等方面进行综述,为同领域的研究者提供一定的参考。