禽类脂肪细胞分化调控的研究进展

前脂肪细胞是一类具有增殖和定向分化为脂肪细胞能力的前体细胞,其分化受众多基因的调控。目前对哺乳动物脂肪细胞分化的认识比较全面而深入,但是有关禽类脂肪细胞分化相关的研究报道比较少。一方面,禽类脂肪细胞诱导分化方式不同于其他物种,外源脂肪酸是必须的诱导剂之一;另一方面,禽类关键转录因子调控脂肪分化的分子机理不同于哺乳动物,具有特异性。本文综述了禽类前脂肪细胞原代培养、诱导分化方式及其分化调控机制的研究进展,旨在为今后深入了解禽类脂肪分化的机理提供理论参考。     

CRISPR/Cas9介导RB1基因敲除及其在鸡前脂肪细胞分化、增殖中的功能研究

旨在研究RB1基因在鸡前脂肪细胞分化和增殖过程中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统在鸡前脂肪细胞中敲除RB1基因,检测鸡前脂肪细胞的分化和增殖能力及相关标志基因的表达水平。结果表明,CRISPR/Cas9系统能够有效介导RB1基因的敲除并引起RB1基因翻译的提前终止,敲除效率可以达到10%。油红O提取比色和CCK-8的结果显示,敲除RB1基因后,鸡前脂肪细胞的分化能力减弱、增殖能力增强;qRT-PCR结果显示,RB1基因敲除之后脂肪细胞分化标志基因G0S2、FAS、A-FABP的mRNA表达水平下降,尤其是G0S2基因的表达水平在前脂肪细胞分化的各个阶段都表现为显著的下降。同时RB1基因敲除还引起细胞周期相关基因CyclinD1、E2F1、Ki67、PCNA的mRNA表达水平升高。初步推断,RB1基因可能是调控鸡前脂肪细胞分化和增殖的关键调节因子。     

TCF21基因对鸡前脂肪细胞增殖的影响

实验旨在研究TCF21基因在鸡前脂肪细胞增殖过程中的功能。以鸡永生化前脂肪细胞系(ICP1)和体外分离培养的鸡原代前脂肪细胞为实验材料,首先利用qRT-PCR实验方法分析TCF21在ICP1细胞和鸡原代前脂肪细胞增殖过程中的表达规律,其次利用CCK-8比色法研究过表达和干扰TCF21基因对鸡前脂肪细胞增殖过程中细胞数的影响,最后利用qRT-PCR实验方法分析细胞增殖过程中标志基因PCNA、cyclinD1和Ki67的表达情况。结果表明:TCF21基因在ICP1细胞和体外分离培养的鸡原代前脂肪细胞的增殖过程中均呈下降趋势;过表达TCF21基因抑制鸡前脂肪细胞的增殖,且细胞增殖标志基因PCNA、cyclinD1和Ki67的mRNA表达水平下调;干扰TCF21基因对鸡前脂肪细胞增殖无明显影响。综上所述,TCF21可能对鸡前脂肪细胞的增殖有一定的抑制作用。     

营养素、生长因子与激素对脂肪细胞生长发育影响的研究

哺乳动物体内有白色与褐色两类脂肪组织。现代研究认为,白色脂肪组织除作为体内能量储存器官外,更多承担能够分泌多类激素与因子的内分泌器官角色。对于构成脂肪组织的脂肪细胞而言,其生长发育与多种生理生化及疾病过程的联系密切。脂肪细胞发育分为前期增殖分化与后期发育两个阶段。一般认为,前期脂肪细胞是通过胚胎干细胞—间充质干细胞—脂肪母细胞—前体脂肪细胞—不成熟脂肪细胞—成熟脂肪细胞的途径不断分化而来的,在不同阶段由不同因子诱导细胞逐步向脂肪细胞分化;而后期脂肪细胞发育则是一个受多因素共同作用的过程,这些因素通过不同途径影响细胞发育。目前发现,葡萄糖、维生素、白细胞介素、前体脂肪细胞分化因子、胰岛素等均可通过不同途径在脂肪细胞发育中发挥效用。笔者通过梳理近年相关文献,总结了脂肪细胞类型与来源,以及营养素、生长因子与激素对脂肪细胞发育的影响。随着对影响脂肪细胞发育因素研究的深入,为后续调控肉品品质、治疗营养代谢病或影响其他生理生化进程提供了有力依据。     

鸡KLF3基因的表达规律及其对脂肪细胞分化的影响研究

为研究鸡KLF3(Gallus gallus Krüppel-like factor 3,gKLF3)基因的表达规律及其对脂肪细胞分化的影响,利用qRT-PCR检测了其在肉鸡脂肪组织和脂肪细胞中的表达特点,并利用基因过表达技术研究gKLF3基因对脂肪细胞分化的影响。结果显示,gKLF3在2~10周龄肉鸡腹部脂肪组织中持续表达,10周龄高脂肉鸡腹部脂肪组织gKLF3表达量显著高于低脂肉鸡(P0.05);gKLF3在鸡成熟脂肪细胞的表达量低于前脂肪细胞(P0.01);体外培养的鸡前脂肪细胞经油酸诱导分化后,gKLF3基因表达量均有低于对照组的趋势;过表达gKLF3基因有抑制脂肪细胞分化,以及抑制C/EBPα、FAS基因表达(P0.01)的趋势。研究结果表明,gKLF3基因在鸡腹部脂肪组织生长发育过程中发挥重要作用,其可能是通过抑制C/EBPα、FAS基因表达进而抑制脂肪细胞分化实现的。     

绵羊前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化

本试验旨在建立绵羊前体脂肪细胞体外培养方法,为从细胞生物学层面研究绵羊脂肪代谢提供基础。选取1只3月龄杜泊羔羊,颈部处死后取腹股沟脂肪组织,利用Ⅰ型胶原酶消化法分离获得前体脂肪细胞,在完全培养液中培养。当细胞汇合成单层后,用MDI诱导剂(1μmol/L地塞米松,10 mg/L胰岛素,0.5 mmol/L IBMX)诱导2 d,再用胰岛素分化剂(10 mg/L胰岛素)分化2 d之后,细胞分化成脂肪细胞,细胞内出现脂滴,随着时间的延长脂滴汇合,最终脂滴充斥整个细胞。通过细胞形态学动态观察、生长曲线绘制、油红O染色以及诱导分化测定等试验证明,这些细胞是功能活跃的前体脂肪细胞,并在体外重现了其增殖分化的全过程。结果提示,绵羊羔羊腹股沟脂肪组织中存在前体脂肪细胞,且可用以建立绵羊前体脂肪细胞的细胞系,这为从细胞生物学层面研究绵羊脂肪代谢提供了重要基础。     

绵羊前体脂肪细胞的原代培养及分化

本试验旨在建立绵羊前体脂肪细胞的原代培养方法,探讨反刍动物脂肪沉积机理.以1日龄羔羊的肾周脂肪组织为试验材料,采用组织块法和酶消化法分离培养前体脂肪细胞,观察形态学变化,测定生长曲线,油红O染色检测细胞内脂肪含量,并用实时定量PCR法检测脂蛋白脂酶、过氧化物体增殖剂活化受体γ、脂肪酸合酶的表达量.结果表明:原代培养的细胞成分均一、增殖旺盛、分化率高,具有前体脂肪细胞的形态特征和基因表达特性,为绵羊前体脂肪细胞.本试验成功建立了绵羊前体脂肪细胞原代培养方法,并在体外重现了增殖和分化的过程.     

共轭亚油酸对艾维茵肉鸡前体脂肪细胞增殖与分化的影响

试验采用酶消化原代培养脂肪细胞的方法培养艾维茵肉鸡前体脂肪细胞.通过细胞形态学观察、细胞计数、油红O染色等方法,观察共轭亚油酸(CLA)对肉鸡前体脂肪细胞增殖与分化的影响.结果表明:CLA对艾维茵肉鸡前体脂肪细胞增殖有显著抑制作用,而对其分化没有显著影响.     

北京油鸡羊膜上皮细胞的分离、培养及分化潜能的研究

旨在研究禽类胚胎羊膜上皮细胞的分离、培养、鉴定及向不同胚层细胞诱导分化等的生物学特性.本研究使用酶消化法从北京油鸡胎膜中分离羊膜上皮细胞,通过免疫荧光和RT-PCR方法鉴定羊膜上皮细胞标志物(Nanog、Oct-4、Sox-2、CK19和Vimentin),并诱导其向成骨细胞、脂肪细胞和胰岛样细胞诱导分化,检测其多向分化潜能.结果表明,酶消化法获得的鸡羊膜上皮细胞不仅表达干细胞特有的标志,而且成功诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和胰岛样细胞.综上所述,北京油鸡羊膜上皮细胞在体外具有较强的自我更新能力及可塑性,可作为种子细胞进行濒危物种的保存,并为日后利用羊膜上皮细胞进行临床治疗提供一定的理论依据,同时也可为油鸡基因的改良提供模型.     

鸡NRF1基因启动子区生物信息学分析

NRF1 (Nuclear Respiratory Factor 1)是调控线粒体功能的重要转录因子.笔者前期研究发现NRF1负调控鸡PPARγ基因,并抑制鸡前脂肪细胞的分化.但是,目前鸡脂肪生成中影响NRF1基因表达的机制尚不清楚.本研究重点开展了鸡NRF1基因启动子区的生物信息学分析.利用NCBI获得鸡NRF1基因...     

囊素对哺乳动物免疫促进作用的研究Ⅰ.囊素对猪瘟疫苗接种猪体液免疫的影响

囊素(bursin)是禽类法氏囊组织产生的一种三肽物质,主要存在于法氏囊组织提取液中[1～2].它在体外能够促进禽类和哺乳动物前体B淋巴细胞的分化和增殖[1～3],在体内能使胚胎期切除法氏囊的小鸡出现法氏囊复生[4],还可显著提高新城疫和法氏囊病疫苗接种鸡的抗体水平[5～6],延长抗体持续时间.这说明囊素对提高鸡的免疫力和疫苗免疫效果具有显著促进作用.但它对哺乳动物是否也具有类似作用,目前尚未见报道,为此,作者进行了本研究,现报告如下.     

新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞原代培养与诱导分化的研究

为建立新西兰兔前体脂肪细胞的体外培养模型,比较新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞分化过程中相关基因的差异表达,实验采集 1 日龄新西兰兔背最长肌和皮下脂肪组织,采用胶原酶消化方法,分别从 2 种组织中分离前体脂肪细胞,进行细胞原代培养,绘制细胞生长曲线,并对肌内和皮下前体脂肪细胞诱导分化,利用 RT-PCR 检测相关基因的表达变化。结果表明:细胞在分离后 2 h 已经贴壁,24 h 时呈现出短梭形的细胞形态,第 2 天细胞变成长梭形,第 3 天进入对数生长期。肌内和皮下前体脂肪细胞在诱导分化后均被油红O 染色,皮下前体脂肪细胞的脂质积累在诱导分化的第 2 天显著高于肌内前体脂肪细胞(P<0.05);荧光定量结果表明,肌内和皮下前体脂肪细胞 CCAAT 增强子结合蛋白(C/EBPα)基因的表达趋势在诱导分化过程中相同,肌内前体脂肪细胞过氧化物酶体增殖激活受体(PPARγ)第 4 天的表达量显著高于第 6 天,而皮下前体脂肪细胞 PPARγ表达量差异不显著;肌内前体脂肪细胞脂蛋白脂肪酶(LPL)表达量在第 0天和第 2天差异不显著,而皮下前体脂肪细胞第 2 天显著高于第 0 天(P<0.05);肌内前体脂肪细胞脂肪酸合酶(FAS)基因第 0、2、4 天的表达量差异不显著,而皮下前体脂肪细胞第 2、4 天显著高于第 0 天(P<0.05)。本研究成功构建了新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞的体外培养和诱导分化模型,并发现皮下前体脂肪细胞分化早于肌内前体脂肪细胞,为进一步研究新西兰兔前体脂肪细胞的分化机制和脂肪沉积奠定基础。     

脂肪细胞去分化及其调控机制研究进展

脂肪发育、沉积及代谢直接影响动物的生产及肉类产品品质,也与人类的健康息息相关。成熟的脂肪细胞在体内和体外均具有去分化生成可增殖细胞的能力,这种可增殖细胞被称为去分化脂肪(DFAT)细胞。DFAT细胞具有多能干细胞的特性和多向分化潜能,可以分化为脂肪细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、成骨细胞和神经细胞等。本文在阐述体内外成熟脂肪细胞去分化的基础上,重点综述了DFAT细胞的多向分化潜能、去分化调控机制及其在猪上的相关研究进展,为通过调控脂肪细胞的去分化,进而改善肉品质、提高人类健康水平提供一定理论依据。     

C-型利钠肽调控鸡肌内脂肪细胞脂肪沉积的作用机制研究

本研究旨在探讨C型利钠肽（CNP）对鸡胸肌组织肌内前脂肪细胞的增殖、分化和分解的调控作用及机制，为进一步阐明肌内脂肪沉积的分子机制奠定基础。以黄羽肉鸡胸肌组织的肌内前脂肪细胞作为体外研究模型，利用10^-7 mol/L CNP激素外源诱导前脂肪细胞，采用CCK8、Edu染色法观察肌内前脂肪细胞增殖的变化，油红O染色和异丙醇萃取法观察脂肪分化和沉积的变化；利用试剂盒检测细胞内cGMP及甘油浓度变化；实时荧光定量PCR检测利钠肽受体A、B、C（NPRA、NPRB和NPRC）的表达变化。结果显示，与对照组相比，CNP诱导前脂肪细胞1和3 d后，细胞的增殖能力显著升高（P<0.05）；CNP诱导3和6 d后，诱导组脂肪细胞的分化和脂滴沉积能力极显著降低（P<0.01），释放到培养基的甘油浓度及细胞中的cGMP的浓度极显著升高（P<0.01）。NPRB和NPRC基因mRNA的表达极显著和显著高于对照组（P<0.01；P<0.05），NPRA基因mRNA的表达无显著变化（P>0.05）。本试验结果表明，CNP通过NPRB/NPRC-cGMP通路调控肉鸡肌内脂肪细胞的脂代谢过程。     

家畜原代前体脂肪细胞离体培养模式研究

本文阐明了家畜原代前体脂肪细胞离体培养模式及其特点、家畜原代前体脂肪细胞有血清培养模式与无血清培养模式、家畜原代前体脂肪细胞离体培养模式中激素、生长因子和细胞因子调控脂肪细胞分化的作用及脂肪细胞离体培养的分化过程以及脂肪细胞分化的鉴定。     

鸡ES细胞体外定向诱导分化特性的研究

旨在探索鸡胚胎干细胞(ES细胞)体外定向诱导的多向分化潜能.分离鸡X期胚盘细胞,体外培养传代,经鉴定后,采用地塞米松(DEX)、β-甘油磷酸钠(β-GP)和维生素C(VitC)诱导ES细胞向成骨细胞分化;采用维甲酸(RA)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)诱导ES细胞向神经元样细胞分化;采用DEX、胰岛素、IBMX诱导ES细胞向脂肪细胞分化,比较不同浓度组合诱导剂的诱导效果,分别用Von Kossa's染色法、甲苯胺蓝染色法、免疫组化法、油红O染色法和RT-PCR鉴定诱导产生的细胞.结果显示,ES细胞被诱导3～21 d后,分化为成骨细胞,诱导率为40％～72％;被诱导4～7 d后,分化为神经元样细胞,诱导率为71％～84％;被诱导2～21 d后,分化为脂肪细胞,油红O染色阳性,并表达PPARγ基因.结果表明,在体外条件下,ES细胞可被特异的化学物质定向诱导分化为成骨细胞、神经元样细胞和脂肪细胞,具有多向分化潜能.     

鸡肺脏间充质干细胞的分离鉴定及其对禽流感病毒的易感性研究

本研究分离并鉴定了1~2周龄雏鸡的肺脏间充质干细胞(MSCs)。显微镜下观察,这些培养细胞呈成纤维细胞样形态。表型上,这些细胞表达对干细胞自我更新和多功能性至关重要的CD44、CD90、CD105和转录因子PouV。鸡MSCs的多向分化潜能性显示其能够被诱导分化成为脂肪细胞和成骨细胞。与鸡骨髓MSCs和哺乳动物MSCs相同,鸡肺脏间充质干细胞具有免疫调节活性并能严重抑制T细胞受有丝分裂原刺激后的增殖。进一步检测了这些细胞对禽流感病毒(AI)H1N1和H9N5的易感性。鸡肺间充质干细胞可以表达已知的α-2,3和α-2,6唾液酸受体,且H1N1和H9N5这2个禽流感毒株都能在其中复制增殖。病毒感染MSCs能引起细胞裂解和细胞因子及趋化因子的产生。对鸡及其他哺乳动物的肺间充质干细胞(MSCs)特性的进一步鉴定将有助于理解肺感染性与非感染性疾病的发病机理和肺损伤修复的机制。     

转录因子互作调控鸡脂肪细胞分化研究

哺乳动物的CAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、CAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(PPARγ)和胆固醇调节元件结合蛋白质1(SREBP1)是脂肪细胞分化调控的重要因子,鸟类脂肪细胞分化的分子调控网络目前还不清楚。本研究利用荧光素酶报告基因检测发现,C/EBPα、C/EBPβ和SREBP1过表达促进鸡PPARγ基因启动子活性(P0.05);C/EBPβ和SREBP1过表达抑制鸡C/EBPα基因启动子活性(P0.05);PPARγ过表达促进鸡FAS基因启动子的活性(P0.05),并抑制鸡LPL和AFABP基因启动子活性(P0.05),但对鸡C/EBPα基因启动子活性没有显著影响(P0.05)。本研究结果为进一步阐明鸡脂肪细胞分化的转录调控网络奠定了基础。     

外源性牛重组瘦蛋白(Leptin)对初生小牛脂肪细胞形态及甘油三酯含量的影响

试验将5mg/L外源性牛重组瘦蛋白(Leptin)添加到培养6d的从初生小牛大网膜前脂肪细胞分化的脂肪细胞培养液中,观察Leptin对脂肪细胞形态及细胞内甘油三酯含量的影响。结果表明,在培养基中加入Leptin后4h,细胞形态发生了显著变化,细胞体积缩小,细胞内的脂肪滴减少。同时,细胞甘油三酯含量降低了32.96%(P<0.05)。结果说明,Leptin可促进体外原代培养的脂肪细胞甘油三酯的分解和脂肪代谢。     

莱芜猪前体脂肪细胞的原代培养及诱导分化研究

为了建立莱芜猪前体脂肪细胞的体外培养体系,探索猪脂肪组织增生的生物学特征。本研究采集1日龄莱芜猪仔猪颈、背部皮下脂肪组织,采用胶原酶与胰蛋白酶相结合的方法,分离原代前体脂肪细胞,进行前体脂肪细胞的原代和传代培养,以及前体脂肪细胞诱导分化的研究,并采用Real-time PCR方法检测前体脂肪细胞分化过程中关键基因PPARγ的表达。结果表明,分离的猪原代前体脂肪细胞约8h后开始贴壁,贴壁的细胞呈短梭形或不规则的三角形,第3天多数细胞进入指数生长期,呈成纤维细胞样形态,细胞生长曲线近似S形;诱导培养结果显示,少量细胞在第2天开始出现脂滴,大多数细胞在第3天出现脂滴,第7～8天小脂滴逐渐融合成大脂滴,在第12天左右融合成大脂滴,油红O染色呈橘红色。在前体脂肪细胞分化过程中PPARγ基因mRNA的表达量逐渐增加,在诱导后的48h表达量最高,随后其表达丰度逐渐下降。本试验成功建立了莱芜猪前体脂肪细胞培养体系和体外诱导分化模型,为进一步研究莱芜猪前体脂肪细胞增殖与分化机制和猪体脂肪的沉积奠定基础。