狍鹿ANXA-2基因编码序列的克隆及序列分析

首次从狍鹿鹿茸组织中成功克隆出包含膜联蛋白A2(ANXA-2)基因全部编码区的c DNA序列。通过生物信息学软件分析表明,该基因的开放阅读框共包含1 020个碱基,编码339个氨基酸,编码蛋白质的相对分子质量为38 612.09,理论等电点为7.224。蛋白保守区预测表明,该基因的蛋白保守区共有4个Annexin结构域。同源比对表明:ANXA-2基因与梅花鹿、马鹿、牛的CDS区的同源性分别为98%、98%和96%。用Mega5.0软件进行物种间遗传距离计算,结果表明该基因与蟾、原鸡的遗传距离最远,与梅花鹿、牛、羊的遗传距离最近。     

家鸭×番鸭杂种下调表达新基因r-MHD2的克隆

以北京鸭、法国番鸭及其正反交F1代杂种为试验材料,采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)方法分析不同试验组肌肉组织基因表达差异,结合抑制性消减杂交(SSH)加以验证,发现一个杂种下调表达基因r-MHD2,对鸭r-MHD2基因698 bp片段BLASTING结果表明,该基因与鸡(Gallus gallus)、非洲爪蟾Xenopus laevis和Xenopus tropicalis同源性分别为91%、78%和77%.r-MHD2基因的具体分子功能尚属未知.     

家鸭×番鸭杂种下调表达新基因r-MHD2的克隆

以北京鸭、法国番鸭及其正反交F1代杂种为试验材料,采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)方法分析不同试验组肌肉组织基因表达差异,结合抑制性消减杂交(SSH)加以验证,发现一个杂种下调表达基因r-MHD2,对鸭r-MHD2基因698 bp片段BLASTING结果表明,该基因与鸡(Gallus gallus)、非洲爪蟾Xenopus laevis和Xenopus tropicalis同源性分别为91%、78%和77%。r-MHD2基因的具体分子功能尚属未知。     

北京鸭β-catenin基因cDNA的克隆和生物信息学分析

试验探讨了北京鸭β-catenin基因的生物学功能,为进一步研究该基因对鸭皮肤毛囊的影响奠定基础。以北京鸭胚胎皮肤组织为材料,根据GenBank中发表的鸡、鹅等物种的β-catenin基因序列,设计并合成4对引物,采用RT-PCR方法,克隆北京鸭β-catenincDNA,并运用DNAMAN软件及在线工具对所得到的序列进行生物信息学分析。结果表明:北京鸭β-catenin基因cDNA长度为2996bp(Genbank登录号为FJ169885),包含由2346个碱基组成的编码区(CDs),有起始密码子ATG和终止密码子TAA,编码781个氨基酸;北京鸭β-catenin基因核苷酸序列与鸡、鹅、中华鳖、人和家猪相应区段(CDs)的同源性分别为95.06%、94.12%、90.11%、84.83%、84.31%;其氨基酸序列与鸡、鹅、中华鳖、猪、人的氨基酸同源性达99%以上,表明在进化关系上,β-catenin氨基酸序列有很高的保守性。     

鸭BLVRA基因部分cDNA的克隆与序列分析

为研究胆绿素还原酶A(Biliverdin reductase A,BLVRA)基因的遗传分化,探索其结构和功能,根据鸡、人、小鼠、牛等动物BLVRA基因编码区的保守序列设计一对引物,以缙云麻鸭输卵管子宫部的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增出鸭BLVRA基因的一段cDNA编码序列,并对其进行测序及序列分析。结果表明:该cDNA序列由634个核苷酸组成,编码211个氨基酸,分子量为24.1ku。与鸡、小鼠、牛、蟾蜍和人的核苷酸相似性分别为92.6%、64.9%、62.8%、69.0%、63.6%;氨基酸的相似性分别为96.2%、59.7%、60.7%、68.4%、59.7%,说明BLVRA基因在进化过程中较为保守。进一步的系统进化分析表明,鸭BLVRA基因与鸡的进化关系最近,蟾蜍次之,小鼠、牛和人较远,与传统的分类地位基本吻合。该基因部分cDNA序列的克隆,为获得BLVRA基因全长及其在各组织中的表达研究奠定了基础。     

猪CAPN3基因的克隆及PCR-SSCP分析

calpain3在肌肉组织中的特异表达,其活性显著影响宰后肉的嫩化。研究利用比较基因组学的方法首次克隆了猪CPAN3基因的内含子16~23,并利用PCR-SSCP方法在外显子1中寻找到1个插入/缺失突变和1个碱基替代,为进一步分析其变异和肉质的关系并进而确定遗传标记提供了基础。     

白绒山羊PH-30基因的克隆及表达

PH-30是参与精卵质膜间相互作用中最有特征性的候选分子之一.为了检测PH-30基因在白绒山羊睾丸中特异表达情况,试验提取公山羊睾丸组织总RNA,反转录合成cDNA,并根据GenBank中公布的3种动物PH-30 cDNA序列的保守区设计1对引物,PCR扩增后纯化回收目的片段,连接pGM-T载体,挑取阳性克隆进行测序,经序列分析鉴定目的片段.结果表明,PCR扩增获得448 bp目的片段,与绵羊PH-30同源性99%.与牛PH-30的同源性为92%.多组织的RT-PCR研究结果表明,该基因只有在自绒山羊睾丸组织中特异性表达,而在其附睾头、体、尾部组织中没有表达.     

猪PGC-1β和PRC基因的部分cDNA克隆及表达分析

以猪心脏组织为材料,克隆猪PGC-1β(PPARγcoactivator-1β)和PRC(PGC-1-related coactivator)基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析,同时明确其组织表达特征。根据人PGC-1β和PRC基因的已知mRNA序列和在猪ESTs数据库中搜索得到的同源序列,利用RT-PCR技术克隆猪PGC-1β和PRC基因的部分cDNA序列,并用SQ-RT-PCR和Western blot方法检测其在猪心脏、肌肉、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏、小肠、脂肪组织中的表达。结果,获得长度分别为1251和1254bp的猪PGC-1β和PRC基因的部分序列,分别编码415和417个氨基酸(GenBank登录号分别为:FJ377680和FJ479791),其核苷酸序列和氨基酸序列与其它物种的同源性均达到80%左右,并包含有TPPT-TPP和DHDY2个保守性序列,以及RNA识别基序(RRM)的保守性结构域。PGC-1β在8个组织中均有表达,而PRC主要在心脏、肝脏、肾脏和骨骼肌中表达,在脾脏和小肠中未检测到。本研究成功获取了猪PGC-1β和PRC基因部分序列,且组织表达存在差异,所获得的结果为研究PGC-1家族的生理功能及调节机制积累了资料。     

牛抵抗素基因的cDNA克隆

<正>抵抗素是新近发现的一种由脂肪细胞分泌的富含半胱氨酸的多肽。人抵抗素基因定位于19p13.3,负责编码108个氨基酸残基组成的抵抗素蛋白。Tokushi确定了478bp的牛抵抗素序列,具有完整的开放阅读框架,负责编码109个氨基酸残基组成的牛抵抗素蛋白。这一序列同人的抵抗素cDNA序列具有83%的同源性。     

IBDV地方变异株VP2基因的克隆与特性鉴定

应用 RT- PCR技术对 1株分离于地方免疫鸡群中暴发的传染性法氏囊病病例的传染性法氏囊病病毒 ( infec-tious bursal disease virus,IBDV) HN0 2 6株的 VP2基因进行了克隆与序列分析 ,并与相应毒株的 VP2高变区核苷酸及氨基酸序列进行了比较研究。结果表明 ,HN0 2 6株的核苷酸和氨基酸序列与变异株 Var- A的同源性最高 ,分别达97.3%和 97.6 % ;其次为超强毒株 UK6 6 1 ,分别为 95 .7%和 95 .2 % ;而和弱毒株 PBG98的同源率仅有 92 .8%和90 .3%。其中 ,在第一、二亲水区 ,HN0 2 6株均有 1个氨基酸发生了变化 ,即第 2 2 2位转变为 E、第 31 8位转变为 D。更重要的是 ,其 2 4 9位和 2 5 4位上的氨基酸分别为 K和 S,这些均为变异株的特性。另外 ,HN0 2 6株的七肽区保持SWSASGS不变 ,且第 2 79位和 2 84位氨基酸分别为 D和 A,又完全具备强毒株的特性。因此 ,初步确定所分离的HN0 2 6为有较强致病力的变异株 IBDV。     

家兔GHSR基因遗传多态性研究

GHSR基因编码促生长激素分泌素受体,被认为是生长性状的候选基因,但其在家兔上的研究甚少。本试验采用PCR产物直接测序法寻找GHSR基因遗传变异,应用HRM分型技术对新西兰兔、加利福尼亚兔和天府黑兔3个肉兔品种共176个个体进行基因型分析。结果表明:在GHSR基因外显子2中存在一个SNP多态位点,位于编码区918bp处(c.918C>T),该SNP为同义突变。c.918C和c.918T在3个品种中平均基因频率分别为0.704 5和0.295 5,3种基因型CC、CT和TT的频率分别为0.557、0.295和0.148。该位点在3个兔群体中均表现为中度多态(0.25相似文献   

云岭黑山羊BMPR-IB基因部分编码区的克隆及多态性分析

应用RT-PCR方法从云岭黑山羊卵巢组织克隆与产羔性状相关的BMPR-IB基因。结果表明,克隆的BMPR-IB基因扩增片段长467 bp,扩增片段位于该基因编码区第497与963位碱基之间,与已报道的野生型山羊、绵羊、猪、人和鼠的BMPR-IB基因该编码区的同源性分别为99%、99%、92%、92%和87%;与野生型山羊相比,云岭黑山羊BMPR-IB基因第498位和575位碱基存在多态性位点,其中第498位碱基由T突变为C,组成的密码仍编码天冬氨酸（Asp,D）,为同义突变;第575位碱基由C突变为T,编码的氨基酸由脯氨酸（Pro,P）变为亮氨酸（Leu,L）,为错义突变;BMPR-IB蛋白的二级结构在错义突变位点可能具有多种构象。本研究结果为深入研究BMPR-IB基因与云岭黑山羊产羔性状间的关系奠定了基础。     

鸭MyoG基因编码区的克隆及其在鸭心肌组织发育中的表达研究

肌细胞生成素(myogenin,MyoG)在胚胎发育中发挥作用,并能与在心脏发育过程中起重要作用的MEF2基因家族协同促进肌肉的分化,而其在心肌发育中的作用却鲜有报道。为研究其在胚胎心肌组织发育过程中的作用,本研究扩增了鸭MyoG基因CDS序列,并采用实时荧光定量PCR法检测了MyoG在鸭E10、E14、E18、E22、E27 d及出生后1周雏鸭(P7 d)心肌组织中共6个阶段的表达变化。基因扩增得到鸭MyoG基因CDS序列共684bp,编码227个氨基酸,预测其含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域。结果表明:MyoG在鸭E10 d中的表达量最高,显著高于E14、E18、E22和E27 d(P0.05);E14 d与E18 d,E22 d和E27 d之间的表达差异不显著(P0.05);MyoG在鸭出壳前心肌组织中的表达量整体呈现下降趋势,出生后1周,表达量又明显上升,与E22 d和E27 d差异显著(P0.05)。MyoG在鸭心肌组织的发育中起作用,其机理可能是通过MyoG的bHLH结构域直接或以MEF2基因家族介导间接实现对心脏发育的调控。     

鸭瘟病毒VP 26基因克隆和分子特性分析

利用作者实验室已构建的DPV CHv株基因文库重组质粒的DNA测序信息,结合NCBI的ORF Finder和BLAST工具分析得到了编码该病毒VP26蛋白基因(UL35)的ORF,然后采用PCR扩增出了VP26基因并将其克隆到pMDl8-T载体上,经PCR和酶切鉴定以及进一步的核酸斑点杂交试验证实该基因即为DPV的VP26基因.分子特性分析表明:该基因大小为354 bp,编码117 aa,包含1个保守结构域,为Herpes_UL35,与小衣壳蛋白家族相关并在Herpes_UL35基因编码蛋白之间高度保守,而且DPV VP26蛋白与GenBank上多种a疱疹病毒同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有较高的同源性.系统进化树分析表明,DPV在分类地位上归属于Alphaherpesvirus亚科,而且有可能属于新的属.另外,亚细胞定位分析表明,VP26主要定位于细胞核中.密码子偏爱性分析结果显示,编码VP26相同氨基酸的不同密码子使用频率有较大的差异,DPV VP26与大肠杆菌、酵母和人的密码子使用偏爱性差异分别有18、19和25个.上述研究结果为进一步研究DPV VP26蛋白的功能和作用机理提供分子生物学依据.     

北京鸭PRLR基因部分序列的克隆及分析

利用PCR方法克隆了北京鸭催乳素受体(PRLR)基因部分序列,该序列长1325bp。序列分析结果表明,该序列由第9外显子的一部分(57bp)、第9内含子(635bp)以及第10外显子的一部分(633bp)组成;在核苷酸水平上,北京鸭的该序列(除去内含子)与鹅(U07694)、鸡(D13154)、野鸽(DQ209271)、火鸡(L76587)的相似性分别为94.2%、88.7%、86.8%、86.1%;在氨基酸水平上,与鹅(ABA71353)、鸡(BAA02439)、野鸽(AAA20646)、火鸡(AAB01544)的相似性分别为93.5%、84.3%、80.8%、80.9%。     

绵羊Lin28基因编码区克隆与序列分析

为研究绵羊Lin28基因的功能,探讨其在绵羊体细胞重编程中的作用,本研究参照GenBank上小鼠、猪、牛和人的Lin28基因mRNA序列的保守区设计简并引物,Trizol法提取100 d左右胎绵羊肠组织总RNA,RT-PCR扩增Lin28基因编码区(CDS)序列,利用生物信息学软件DNAMAN、BioEdit和在线软件NCBI BLASTn、PlantsP和ScanProsite等分别进行核苷酸和推导的氨基酸序列比对,构建进化树,分析蛋白功能结构域并推测氨基酸序列的三维结构。结果显示,绵羊CDS区为包括终止密码子在内的630 bp,编码209个氨基酸。同源性分析结果表明,其与爪蟾、斑马鱼、鸡、牛、马、猫、猪、人、大鼠和小鼠的核苷酸序列同源性分别为53.8%、55.2%、70.2%、88.3%、88.7%、89.2%、89.5%、90.5%、95.9%和98.9%;氨基酸序列同源性分别为76.5%、67.9%、93.2%、99.3%、97.7%、99.3%、99.3%、98.5%、99.3%和100.0%。生物信息学分析显示,绵羊Lin28蛋白含有2个CCHC型的锌指结构和1个冷休克结构域。结果表明,本试验成功克隆Lin28基因的编码区,为进一步研究Lin28基因的功能及探讨其在绵羊体细胞重编程中的作用奠定基础。     

Cloning and Sequence Analysis of Lin28 Gene Coding Region from Sheep

The assay was aimed to study the function of Lin28 gene of sheep,in this study,according to the Lin28 gene mRNA sequence of mice,pigs,cattles and human in GenBank,the degenerate primer was designed.Total RNA was extracted by Trizol from intestine of 100 d sheep embro,and CDS sequence of the gene was amplified by RT-PCR using the primer.Using a series of bio-software such as DNAMAN,BioEdit and NCBI BLASTn,PlantsP,ScanProsite online and so on,we analyzed the homologies between nucleotide and deduced amino acid sequences,constructed phylogenetic tree,analyzed protein functional domains and deduced three-dimensional structure of amino acid sequence.The results showed that the sequence of sheep Lin28's CDS including stop codon,was in a length of 630 bp,encoded 209 amino acids.Analysis of homology showed that sheep Lin28 gene also shared 53.8%,55.2%,70.2%,88.3%,88.7%,89.2%,89.5%,90.5%,95.9% and 98.9% nucleotide homologies and 76.5%,67.9%,93.2%,99.3%,97.7%,99.3%,99.3%,98.5%,99.3% and 100.0% amino acid identities with Xenopus laevis,Danio rerio,Gallus gallus,Bos taurus,Equus caballus,Felis catus,Sus scrofa,Homo sapiens,Rattus norvegicus and Mus musculus,respectively.Two zinc finger domains and one cold shock domain could be found by bioinformatics analyzing.The successful cloning of Lin28 revealed that the gene in the structure and function was very conservative and helpful to study gene function and its role in somatic reprogramming in future.     

鸭肥胖基因的分子克隆、序列分析及原核表达

根据人、小鼠、猪等动物的肥胖基因编码区序列的保守性设计1对引物，利用RT-PCR技术扩增出鸭肥胖基因的cDNA编码序列，将PCR产物插入pGEM-T载体，经：PCR和双酶切鉴定正确后进行序列测定，分析表明该cDNA序列由438个核苷酸组成，编码146个氨基酸组成的多肽，鸭与人、猪、小鼠、大鼠的核苷酸相似性分别为83％、84％、98％、94％；氨基酸的相似性分别为86％、83％、99％、96％。为了研究鸭肥胖基因体外表达的特点，构建了原核表达载体pET-28a-Ya，在大肠杆菌中进行了诱导表达。结果表明，鸭肥胖基因在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达，融合蛋白分子量约为20ku，其中16ku为鸭肥胖基因表达的蛋白质，经薄层扫描分析，目的蛋白约占菌体总蛋白的30％。鸭肥胖基因的克隆和表达研究，为进一步研究鸭leptin的功能与应用奠定了基础。     

鸭干扰素刺激基因的克隆、表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆、表达鸭干扰素刺激基因（interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5）并制备其多克隆抗体。根据GenBank公布的绿头鸭IFIT5（登录号：KF956064）序列设计特异性引物,PCR扩增获得鸭IFIT5基因,并构建原核表达重组质粒pET-30a-IFIT5和pET-32a-IFIT5及真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5。原核表达获得鸭IFIT5重组蛋白后,进行SDS-PAGE分析,并利用镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化。以纯化的鸭IFIT5重组蛋白为免疫原制备兔抗鸭IFIT5多克隆抗体。利用间接ELISA测定多克隆抗体效价、用Western blotting鉴定其特异性;将真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5转化BHK21细胞,通过间接免疫荧光法鉴定多克隆抗体的反应性。结果表明：目的蛋白主要以包涵体的形式存在;制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体效价达1：49 600,可特异性识别鸭IFIT5重组蛋白,间接免疫荧光试验则表明纯化的多克隆抗体可特异性识别BHK21瞬时真核表达的鸭IFIT5蛋白。综上,成功克隆了鸭干扰素刺激基因IFIT5,制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体可用于鸭IFIT5蛋白的检测,可为鸭IFIT5蛋白的后续研究提供材料支撑。