荧光定量PCR技术及其在动物传染病定量检测中的应用

荧光定量PCR是近年发展起来的一 种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核 酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR 技术的有机结合,而荧光探针是荧光定量 PCR的核心。目前报道的荧光探针主要有 TaqMan、Amplisensor、分子信标、Lightcycler 以及在这4种探针基础上发展起来的其他荧 光探针。各种荧光探针在定量PCR中的作 用是识别和报告特定核酸。这些荧光探针与 相应的靶分子杂交时经历一个自发荧光形成 或消失的构象变化,只有与完全互补的靶核 酸杂交时才会出现这种变化,当靶核酸存在 碱基错配或缺失时,荧光探针就不会与之杂 交,也不会出现荧光的变化。在检测时根据 这种荧光变化来确定检测中特定核酸的存在 和量的多少。荧光探针用于定量PCR不但 提高了PCR的检测灵敏度,还能在同一封闭 管中对模板进行准确定量检测,特别适合特 定核酸扩增的实时监测。荧光定量PCR用 于动物传染病的诊断,不但能定量检测病原 体感染的强弱和在机体内的分布,还具有灵 敏、快速、省力的特点。     

荧光定量PCR技术及其在动物检疫中的应用

作为体外基因的快速扩增技术,PCR的应用存在很多局限性,如伴随高敏感性而引起的假阳性、EB染色对操作者的危害及环境的污染。为了克服这些缺陷,荧光定量PCR(fluorescence quantitative poly-merase chain reaction,FQ-PCR)应运而生,FQ-PCR解决了传统PCR方法不能准确定量、易交叉污染等实际问题,反应过程中通过实时监测PCR反应体系中的荧光信号便可得知靶序列初始浓度,从而达到快速定性、定量检测的目的。按照荧光产生的原理,可将FQ-PCR分为染料法和探针法两种类型。染料法是在常规PCR反应体系中加入SYBR Green I等荧光染料,…     

荧光定量PCR技术及其应用研究进展

荧光定量PCR是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR技术的有机结合,而荧光探针是荧光定量PCR的核心.荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应争特点,是对原有PCR技术的革新,扩大了PCR的应用范围.论文综述了FQ-PCR技术的原理、FQ-PCR实时定量检测系统及其应用.     

猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

通过RT-PCR方法克隆了猪瘟病毒(CSFV) 5′端非编码区(UTR)的一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.同时根据GenBank中的靶序列设计了用于FQ-PCR的一对引物和一条TaqMan探针.通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了CSFV检测的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为 109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为19.73、22.95和26.24;变异系数分别为0.61%、1.77%和1.18%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度.     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

根据沙门菌保守的fimY基因序列设计合成了引物和TaqMan探针，建立了快速检测沙门菌的实时荧光定量方法，并对反应条件进行了优化，组装成快速检测试剂盒。通过对临床样品的检测，该试剂盒的检测灵敏度达4.5CFU（25μL反应体系），比常规PCR高100倍，而且稳定性良好，至少可以冷冻保存9个月。结果表明，所建立的沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点，适于大量样品的检测。     

实时定量PCR技术在动物疫病研究中的应用

实时定量PCR（real-time quantitative PCR）是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术。实时定量PCR继承了PCR技术灵敏、快速、特异的优点,同时又克服了PCR技术中存在的假阳性率高、易污染、EB染料对实验人员的危险以及不能进行准确定量等缺点。实时定量PCR实现了PCR从定性或半定量到准确定量的飞跃,目前,已经成为分子生物学和医学研究等领域的重要工具。本文就实时定量PCR技术及其在动物研究领域中的应用作一综述。     

口蹄疫病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测口蹄疫病毒(FMDV)的方法,本研究根据GenBank中FMDV的2B基因序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,将2B基因克隆到pBlueScriptSK(-)载体中,利用T7体外转录试剂盒制备标准品,通过优化反应条件,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于3％.本研究建立的FMDV TaqMan荧光定量PCR方法对FMDV的快速检测具有重要意义.     

鹅GHR基因荧光定量PCR险测方法的建立

采用PCR方法克隆了鹅生长激素受体(GHR)基因,构建了重组质粒pMD-18T-GHR,并将其作为标准阳性模板.通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-18T-GHR为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测GHR的荧光定量PCR方法.结果显示,该方法构建的标准曲线线性关系良好,建立的GHR基因荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强(可以检测出低于10个拷贝/μL的样品),准确可靠.籽鹅和莱茵鹅GHRmRNA出壳到90日龄生长过程中肝脏中的表达量不同,30日龄不同组织表达量各有变化特点.     

荧光定量PCR检测技术及其在猪病诊断中的应用

荧光定量PCR技术是在常规PCR技术上发展起来的新兴技术,因其特异性强、灵敏度高、自动化程度高、定量准确、重复性好、全封闭反应无污染,在疾病诊断中的应用越来越广泛,受到越来越多人的关注。文章综述了荧光定量PCR技术的基本情况及其在猪病诊断中的应用。     

鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和TaqMan探针,建立鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit, CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R²=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。     

.基于TaqMan探针的牛布氏杆菌实时荧光定量PCR的特异性鉴定

根据牛布氏杆菌BM28保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定牛布氏杆菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105~5.0×101拷贝范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝每微升。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在牛布氏杆菌的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

猪戊型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中注册的AJ272108等序列,参考有关文献,利用引物设计相关软件在HEV ORF2片段的保守区设计并合成1对引物及探针,采用TaqMan探针建立了荧光定量PCR法。以鉴定正确的质粒为模板建立标准曲线,Ct值线性范围为14.89~27.02,相关系数为0.996。本试验建立的猪戊型肝炎病毒ORF2片段基因实时荧光定量PCR方法扩增效率高、线性范围广,为快速检测猪戊型肝炎病毒的绝对定量分析奠定了基础。     

梅迪-维斯纳病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测梅迪-维斯纳病毒(MVV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,本研究根据MVV核苷酸保守序列设计引物和探针。以梯度稀释的含有MVV目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105～5.0×101拷贝范围内定量PCR均有S型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝。对羊的其他病毒核酸均无扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高,特异性好,在MVV的快速检测中具有良好的应用前景。     

探针实时荧光定量PCR检测白藜芦醇体外抗鸭瘟病毒活性方法的建立及应用

建立以TaqMan荧光探针为特点的PCR,检测白藜芦醇体外抗鸭瘟病毒活性。本研究针对鸭瘟病毒UL30基因序列设计特异性引物和TaqMan荧光探针,建立鸭瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证方法的特异度、敏感度和稳定性及对临床样品进行检测;运用该方法检测白藜芦醇对鸭胚成纤维细胞接种鸭瘟病毒后细胞中病毒增殖情况的影响,用以评价该药物体外抗鸭瘟病毒效果。结果显示,该方法建立的定量标准曲线阈值循环数（Threshold cycle,Ct）与模板拷贝数呈良好线性关系（R2=0.997）,斜率为-3.328,扩增效率（E）为99.7%,具有良好的特异度、敏感度和稳定性并能对临床样本进行准确的检测。运用该方法检测白藜芦醇体外抗鸭瘟病毒结果显示：经白藜芦醇处理后,染毒细胞中病毒拷贝数为（7.71±0.37）×10^4,与病毒对照组比较（5.63±0.26）×10^6明显减少（P〈0.01）。结果表明,TaqMan探针实时荧光定量PCR方法建立并成功用于体外药物抗鸭瘟病毒的检测;白藜芦醇具有良好的体外抗鸭瘟病毒活性。     

血清1型鸭甲型肝炎病毒实时定量PCR检测方法的建立与初步应用

为建立了一种可检测血清1型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-1）的实时定量PCR方法,根据GenBank中DHAV-1 5,非编码区的保守区,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,以构建的重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,并对所建立方法进行了特异性、敏感性和可重复性试验以及临床病料检测初步应用。结果,该方法与血清3型鸭甲型肝炎病毒、鸭瘟病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、呼肠孤病毒、传染性支气管炎病毒等无交叉反应性;最低可以检测到10copies/μL;组内和组间变异系数均小于3%;临床病料的检测结果与测序检测结果一致。结果表明,所建立的实时定量检测方法具有特异、敏感、稳定等优点,可用于DHAV-1的快速检测与定量分析。     

猪圆环病毒Ⅰ型荧光定量PCR检测方法的建立

以定量的10倍系列稀释的质量pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了PCV1检测的荧光定量PCR方法.结果表明该方法检测灵敏度可达1.0×104拷贝/μL,线性范围为1010～101;对起始浓度为1.0X107、1.0×106、1.0×106拷贝/μL的标准品的最终实际测得值分别为1.001×107、0.869×106和0.988×105拷贝/μL,变异系数分别为4.758%、1.865%和3.836%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR(nPCR)具有相近的灵敏度.     

鸭呼肠孤病毒TaqMan与SYBR Green荧光定量检测方法的建立及比较

本研究旨在针对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)建立两种快速、敏感、特异的荧光定量PCR诊断方法并对其临床实用性进行比较。试验根据呼肠孤病毒S1基因序列设计合成1对特异性引物和1条MGB探针,分别建立TaqMan和SYBR GreenⅠ两种荧光定量PCR检测方法,并对两种方法的特异性、灵敏性、重复性进行比较。结果显示,两种检测方法标准曲线的相关系数均为0.999,对鸭细小病毒(DPV)、A型鸭甲肝病毒(DHV-1)、C型鸭甲肝病毒(DHV-3)、鸭传染性支气管炎(IBV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鹅星状病毒(JSHV)的检测结果均为阴性,特异性良好。SYBR GreenⅠ法的最低检测限度为10⁰拷贝/μL,TaqMan法的最低检测限度为10¹拷贝/μL,前者的灵敏度比后者高10倍。SYBR GreenⅠ法和TaqMan法重复性试验的组内和组间变异系数均分别小于2.1%和1.8%。利用这两种方法对临床30份疑似病料进行检测,其中TaqMan法检出29份,SYBR GreenⅠ法检出30份,符合率为97%。综上,两种荧光定量方法均可用于临床NDRV...     

荧光定量RT-PCR检测猪日本脑炎病毒

通过RT-PCR方法克隆了日本脑炎病毒(JEV)N基因片段序列,构建重组质粒作为标准阳性模板,同时根据GenBank中的靶序列设计了荧光定量R-PCR的1对引物和1条TaqMan探针.通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了JEV检测的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108和1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为17.33、20.52和23.90,变异系数分别为0.54%、0.74%和0.53%,均小于5%.对阳性组织病料的检测表明该方法的灵敏度高出常规PCR,与套式PCR(nested-PCR,nPCR)具有相近的灵敏度.     

猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。