香蕉枯萎病菌pacC基因的克隆与序列分析

采用PCR和RT-PCR方法扩增尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f sp.cubense,FOC)1号和4号生理小种的pacC基因(FOC1-pacC,FOC4-pacC),对FOC1-pacC和FOC4-pacC相似序列进行搜索和比对,以及对基因编码蛋白进行结构预测,发现FOC1-pacC和FOC4-pacC开放阅读框分别为1 863、1 905 bp,编码634、620个氨基酸,2个小种之间基因序列和氨基酸序列差异明显,FOC1-pacC比FOC4-pacC缺少1个基因片段,FOC-pacC与其相似序列有显著差异,比对缺少2个基因片段;初入侵转录组表达分析说明,2生理小种pacC基因在小种侵染不同品种香蕉过程中表达有差异,FOC1-pacC基因只在粉蕉中检测到表达,而FOC4-pacC则在粉蕉和香蕉中都检测到表达,但在粉蕉中的表达量明显高于香蕉。     

cDNA-AFLP结合BSA研究马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因差异表达片段

通过对具有 6个无毒基因不同表型的马铃薯晚疫病菌构建的 4个混合池进行cDNA AFLP分析 ,得到与 6个与无毒基因相关的差异表达片段 (TDFs) 85条 ,其中与无毒基因Avr1相关的为 2 0条 ,Avr2 2 8条 ,Avr3 Avr10 Avr1116条 ,Avr4 2 1条。差异表达片段大小主要分布在 10 0bp和 30 0bp之间 ,最小片段为 6 0bp ,最大片段 4 40bp。差异表达片段的获得将有利我们下一步克隆全长无毒基因和对晚疫病垂直抗性机制的研究     

利用DDRT-PCR分析茶树冬季冷驯化过程中基因表达的差异

采用DDRT-PCR方法对茶树冬季冷驯化过程中3个样品基因差异表达进行初步研究。结果表明,抗寒性不同的茶树存在基因差异表达。从134条差异片段得到稳定扩增的差异片段31条。根据差异片段的序列设计引物对部分片段进行RT-PCR鉴定假阳性,得到10个阳性片段,其中6个表达量增加,4个表达量降低。经过BLAST比对分析,这些基因与多种植物基因同源性较高,如nectainⅢ蛋白基因(3)、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶蛋白家族基因(48)、微管蛋白特异性C伴侣基因(52)、光合系统Ⅱ蛋白D1基因(80、138)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(147),15、82、134和葡萄的蛋白同源性较高。72经比对没有同源性序列。     

安吉白茶正常与白化叶片基因表达差异的初步研究

用mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)研究了茶树温敏突变体——安吉白茶正常叶片和白化叶片的基因表达差异。从58个差异表达的片段中通过半定量RT-PCR鉴定出12个阳性片段,其中5个片段在正常叶片中特异表达,4个在白化叶片中特异表达,1个在绿色叶片中上调表达,2个在白化叶片中上调表达。通过与GenBank BLASTX比对分析,5个基因片段比对出相似序列,分别为拟南芥的血红素结合蛋白家族中心区域基因、甜菜的甲硫氨酸合酶基因、苜蓿的一个逆转座子基因、人类20号染色体上的一段3-磷酸甘油醛脱氢酶假基因和玫瑰的ACC合成酶基因,其余7个片段未比对上同源序列,可能为新基因。     

芒果炭疽病菌环境pH信号调控基因PalF的克隆与分析

通过本地查找胶孢炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)橡胶菌株全基因组测序数据,获得PalF基因的序列信息。利用同源克隆的方法扩增胶孢炭疽病菌芒果菌株PalF基因,获得片段大小为2 369 bp的目的基因片段。对该基因序列进行分析发现,该片段含有完整的开放式阅读框,与橡胶炭疽菌PalF基因的序列同源性达100%。用RT-PCR的方法获得PalF基因的cDNA序列,序列进行分析发现该基因全长为2 310 bp,其中含有1个大小为59 bp的内含子,推测编码769个氨基酸。对PalF基因的氨基酸序列进行推测保守结构域分析可知PalF蛋白中含有Arrestin-C保守结构域,推测该基因参与环境pH感应信号转导途径(Ambient pH-sensing signal transduetion pathway)的调控,为进一步研究该基因在环境pH感应信号转导途径中的作用奠定了基础。     

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX具有抑菌、抗褐变和保鲜功能。以短短芽胞杆菌菌株FJAT-0809-GLX总DNA为模板,采用PCR扩增超氧化物歧化酶(Supseroxide dismutase,SOD)基因,将该片段纯化回收后与p MD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,进行序列测定,结果显示SOD基因序列长度为609 bp(Gen Bank登录号:KM255665),编码202个氨基酸残基。将SOD基因片段与同样酶切的表达载体p ET-28a连接,构建重组表达载体p ET-28a-SOD,转入大肠杆菌BL-21,采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,在菌体中存在约25 ku的蛋白表达产物,与该基因ORF预期大小接近。以上结果为进一步研究该酶的生理生化特性奠定了基础。     

胶孢炭疽病菌环境pH应答转录调控因子基因的克隆与分析

参照油梨炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的环境pH应答转录因子基因Pacl设计l对特异性引物,以芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)基因组DNA为模板,扩增获得大小为2 625 bp的目的基因片段.序列分析结果表明,目的片断包含完整的阅读框,与油梨炭疽病菌C.gloeosporioides pac1基因相应片段长度相同,二者碱基序列同源性达97%.用RT-PCR技术获得pacl基因cDNA片段,证实目的基因片段中存在3个大小分别为59,50,71 bp的内含子.拼接的全长cDNA长1 755 bp,推测编码的氨基酸序列长584个氨基酸残基,与推测的油梨炭疽病菌pacl基因所编码的蛋白质同样大小,二者氨基酸序列相似性达99%,只有1个氨基酸的差异,可以肯定克隆的目的片段为C.gloeosporioides pac1基因,为进一步研究C.gloeosporioides侵染芒果时的pH调控奠定了基础.     

DDRT-PCR技术分离枇杷幼果低温诱导相关基因

采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术,分离枇杷‘早钟6号’幼果在0℃低温胁迫6h后差异表达的基因。共分离到19个差异表达的基因片段,经反向Northern杂交,得到了4个阳性的枇杷低温诱导相关基因片段(编号为CSIGE1～4-Cold Stress Induced Genes in Eriobotrya japonica1～4)。结果显示:CSIGE1只在低温处理的枇杷果实中表达,这表明该基因与低温逆境有关;CSIGE2和CSIGE3是受低温诱导的上调表达基因;而CSIGE4登录号为GT617706,未搜索到与任何基因有相似性,可能为新基因。     

甘蓝型油菜三种种子储藏蛋白和丙酮酸羧化酶基因片段的克隆及hpRNA表达载体的构建

利用PCR从甘蓝型油菜(B rassica napusL. )华双4号基因组DNA中扩增出种子储藏蛋白cruciferin、nap2 in、oleosin和丙酮酸羧化酶( PEPC) 基因片段,再以扩增出的片段为模板设计引物从一端扩增出4个相应的小片 段,然后将同一基因的大小两个片段反向连接,插入到种子特异表达载体2300 - nap多克隆位点的nap in启动子和 nos终止子之间,构建成可以在油菜种子中转录表达发夹RNA (Hairp in RNA, hpRNA)结构的植物表达载体。     

油菜抗菌肽基因BnLTP1的克隆表达及活性

为研究转脂蛋白(lipid transfer protein,LTP)作为抗菌肽在油菜防御反应中的作用,利用生物信息学的方法,从油菜中筛选获得了一个转脂蛋白类抗菌肽基因,命名为Bn LTP1。Bn LTP1基因长度为93bp,编码31个氨基酸残基。抗菌肽Bn LTP1分子量约为3.4k Da,其序列中的4个半胱氨酸形成两个分子内二硫键,对于稳定抗菌肽的结构起到至关重要的作用。通过overlap PCR的方法对该基因进行体外人工合成,并克隆到p ET30a/His-EDDIEGFP表达载体上进行体外原核表达。抑菌活性实验检测发现,Bn LTP1对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母菌都有较强的抑菌活性;对植物病原真菌(核盘菌、灰霉菌和稻瘟病菌)等也具有抑菌活性。     

猪链球菌细胞外蛋白因子Ef基因的克隆与原核表达

采用分子克隆手段，将Ef全长基因克隆至表达载体pGEX-6p-1的Ptac启动子下游，电击转入大肠杆菌E.cohi BL21(DE3)中表达。经PCR扩增和蛋白质凝胶电泳鉴定，表明该EF蛋白获得有效表达，为进一步构建猪链球菌Ⅱ生物工程疫苗提供前期载体。     

茶尺蠖丝氨酸蛋白酶基因EoSP1的克隆、时空表达及对饥饿的表达响应

丝氨酸蛋白酶是鳞翅目昆虫消化系统中一类重要的蛋白酶。本研究从茶尺蠖（Ectropis obliqua）中克隆到一条丝氨酸蛋白酶基因EoSP1并分析了其结构特征和表达特性。EoSP1基因序列全长858 bp,编码285个氨基酸,预测蛋白分子量为29.53 kDa,等电点为5.44。经与其他丝氨酸蛋白酶比对,EoSP1含有保守的丝氨酸蛋白酶催化位点（H₉₅,A₁₆₁和S₃₂₈）及蛋白互作结构域,与蓓带夜蛾（Mamestra configurata）中SPs亲缘关系较近。进一步获得了与EoSP1-GST融合蛋白大小接近的目的蛋白。qRT-PCR分析发现,EoSP1在幼虫期的表达显著高于成虫、蛹和卵期,并在幼虫中肠中特异性表达;饥饿处理后EoSP1表达下降,恢复饲喂后表达量接近对照组。以上结果为茶尺蠖消化酶功能解析及抗虫新靶点的筛选提供了依据。     

花生类受体蛋白激酶AhAlSRK的原核表达与体外活性分析

基于对已有转录组数据的分析，发现花生AhAlSRK（LOC107458489）基因在耐铝花生品种99-1507和铝敏 感型花生品种中花2号（ZH 2号）受铝毒害后基因表达量出现明显差异，暗示其可能参与花生铝胁迫下信号传递铝 胁迫响应机制。花生AhAlSRK 基因与拟南芥富含亮氨酸类受体蛋白激酶（leucine-rich repeat receptor-like kinases, LRR-RLKs）VIII_2亚家族中的AT1G56140 基因具有相似的结构，为同源基因。为验证花生AhAlSRK蛋白激酶活 性，克隆了AhAlSRK 的全长编码序列，并基于对AhAlSRK蛋白结构预测的基础上，克隆了AhAlSRK的胞内域，构建 其原核表达载体pGEX-6p-1-AhAlSRK-CD，转入大肠杆菌菌株Rosetta 2 (DE3) plysS。在1 mmol/L IPTG 条件下， 16 ℃低温诱导过夜，成功诱导可溶性GST-AhAlSRK-CD蛋白。重组蛋白GST-AhAlSRK-CD表达效率较高，经过自 磷酸化检测验证其具有丝/苏氨酸和酪氨酸激酶活性。实验结果为后续在蛋白质水平上探究AhAlSRK 基因响应铝 胁迫机理打下基础。     

香蕉束顶病毒海南分离物DNA2编码区的克隆及抗血清的制备

利用PCR方法克隆香蕉束顶病毒海南分离物(Banana bunchy top virus,BBTV-HN)DNA2编码区,将其插入到原核表达载体pGEX-6p-1谷胱苷肽-S-转移酶(GST)基因下游.所得克隆pGEX-HN-B2测序结果表明,插入的DNA2片段为267 bp,且表达相位和理论上设计的完全一致.把此重组质粒转化到E.coli Rosetta(DE3)中,经过异丙硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后出现约33 Ku融合蛋白质表达条带.为获得特异的血清,切下目的表达条带并免疫兔子.经Western-blotting检测,获取的血清可以和表达的33 Ku融合蛋白特异结合,表明已成功获得DNA2编码蛋白的血清.     

香蕉束顶病毒海口分离物NSP基因的原核表达

应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆NSP (Nuclear shuttle protein)基因的编码区,并通过Gateway技术定向重组到原核表达载体pDEST~(TM)-17中的6xHis标签下游,经菌落PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了原核表达载体pDEST~(TM)-17-NSP.阳性克隆转化Ecoli BL21(DE3),经IFFG诱导表达、SDS-PAGE分析和western blot检测,结果显示,融合蛋白以包涵体的形式稳定表达,分子量约为20 ku,与预计值相符.通过诱导条件的优化,确定了最佳的融合蛋白表达条件为25℃、0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4h.从而为制备NSP多克隆抗体和进一步研究NSP的功能奠定了基础.     

抗黄曲霉毒素单链抗体基因的克隆与表达

为降低黄曲霉毒素大量样品的制备成本,在实验室已有的抗黄曲霉毒素单克隆抗体8F6的基础上,成功克隆得到了该单克隆抗体的重链（VH）和轻链可变区（VL）基因片段。通过重叠延伸PCR的方法将轻、重链可变区基因连接,并引入连接肽(Linker) 编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体(ScFv)基因, 并将该基因克隆到噬菌体表达载体pCANTAB 5E 上,使单链抗体以噬菌体展示形式在大肠杆菌TG1 中表达。间接竞争ELISA方法检测到该ScFv对黄曲霉毒素B1的抑制率（IC50）值为0.57ng/mL,表明该单链抗体与亲本鼠单抗有相同的抗原结合特异性,且具有很高灵敏度。     

湘油15 PGIP9蛋白基因的克隆和蛋白序列结构分析及原核表达

运用生物信息学软件对湘油15 PGIP9基因的核苷酸、蛋白氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测.结果表明:湘油15 PGIP9编码区CDS长1011 bp,编码336个氨基酸的开放阅读框,分子量为37.5kDa,等电点为7.9.N端1～22个氨基酸是信号肽,且这一区域疏水性较强,具有5个潜在的N-糖基化位点.N端和C端还各具有4个参与二硫键形成的半胱氨酸残基.二级结构显示有11个α-螺旋,14个β-延伸和25个无规则卷曲.中心LRR结构域由6个串联的LRR基序组成.随后将PGIP9的CDS序列亚克隆到原核表达载体pET -32a(+)中,构建pET - 32a - PGIP9重组表达质粒,并转化E.coil BL21(DE3),25℃,终浓度为0.2 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG诱导2h,都成功的表达了融合蛋白pET - 32a - PGIP9,其分子量约为52kDa,发现主要以包涵体形式存在.没有可溶形式的蛋白表达.     

橡胶树炭疽菌CsHog1基因的克隆和原核表达分析

HOG MAPK途径在植物病原真菌生长发育、致病过程和对杀菌剂敏感性等方面发挥重要功能,但在不同的病原真菌中具有一定差异。为研究Hog1蛋白在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)中的功能和调控机制,本研究利用同源克隆法克隆获得橡胶树炭疽菌(C. siamense)的CsHog1基因,构建GST-CsHog1融合表达载体,利用SDS-PAGE和WesternBlot检测蛋白表达情况。结果表明:橡胶树炭疽菌(C.siamense)的CsHog1基因大小1383 nt,编码459个氨基酸,包含5个内含子,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域;聚类分析显示橡胶树炭疽菌的CsHog1基因编码的氨基酸序列与黄瓜炭疽菌的ClOsc1(Hog1同源基因)同源性最高。所构建的蛋白融合表达载体在供试条件下(IPTG0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L;温度16、25、28℃)均可较好诱导表达,GST-CsHog1融合蛋白大小约为70 ku。用GST亲和层析柱纯化获得蛋白,经Western Blot检测显示该蛋白可与GST单克隆抗体特异性结合。     

玉米质体型淀粉磷酸化酶抗体的制备

通过同源基因基因克隆、原核表达载体构建、GST融合蛋白诱导表达与纯化、新西兰大白兔免疫、抗血清分离和纯化制备了SPI多克隆抗体,并进行了玉米体内蛋白Western blot验证。结果表明,成功构建的PGEX-6T-1-SPI-C表达载体在大肠杆菌中表达并纯化了GST-SPI-C融合蛋白,通过免疫新西兰大白兔制备并纯化了SPI多克隆抗体。制备的SPI多克隆抗体不但能识别GST-SPI-C融合蛋白,而且能识别玉米体内全长SPI蛋白(112 kD),并具有较好的特异性。玉米子粒和胚乳的Western blot检测表明,SPI蛋白主要积累在胚乳中,与mRNA定量结果一致。     

水稻种子特异性谷蛋白GluB1启动子在水稻愈伤组织中驱动外源基因表达

【目的】水稻谷蛋白启动子GluB1(GluB1promoter,pGluB1)常用于外源基因在种子中特异性高效表达的研究,也是研究种子储藏蛋白基因表达调控机制的模型。前人研究表明,pGluB1只在水稻胚乳中表达,而在根、茎、叶片、叶鞘、颖壳等组织中均无表达活性。研究的目的是为了克服种子特异表达启动子筛选周期长的缺点。【方法】将由pGluB1驱动的霍乱毒素B亚单位和重组胰岛素原组成的融合基因(a fusion gene of the cholera toxin B subunit and human proinsulin, CTBIN)表达载体pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-NOS经农杆菌介导法转化水稻成熟胚愈伤组织。通过RT-PCR和蛋白质印迹杂交试验检测融合基因CTBIN在水稻愈伤组织中的转录和翻译表达。【结果】获得的7个转基因愈伤克隆中,有6个克隆的融合基因CTBIN在转录水平上表达。选取其中4个克隆进一步进行蛋白质印迹杂交试验检测证实融合基因CTBIN均在翻译水平上表达,而且从分子量大小推断融合蛋白包含的谷蛋白GluB1的N-端信号肽序列(24个氨基酸残基)在所测的愈伤组织细胞中均被成功切除。【结论】水稻种子特异性启动子pGluB1在愈伤组织中具有驱动外源基因表达活性,种子蛋白体亚细胞定位信号肽序列可在愈伤组织细胞中被切除。这为在愈伤组织细胞中快速检测种子特异表达启动子活性和探索愈伤组织中蛋白质的亚细胞分拣机制奠定了基础。