玉米Mutator转座子的结构特征与作用性质

玉米转座子系统主要有En/Spm系统、Ac/Ds系统和Mutator系统3大类,其中Mutator转座子易于插入到基因内部及基因周围,引起的正向突变频率为10-4~10-5,比野生玉米高出近30倍,所引起的突变大部分为隐性突变。由转座子引起的突变,可以通过TAIL-PCR的方法对相关的突变基因进行克隆。本文主要对Mutator转座子的种类、结构特征和作用性质进行综述,并对Mutator转座子的研究应用进行展望。     

西瓜细菌性果斑病菌基因Aave-3192和Aave-2108的功能研究

从本实验室构建的西瓜细菌性果斑病菌菌株A13的Mini-Tn5转座子突变体库中筛选出2株致病性丧失的突变菌株166和167,亚克隆及测序结果表明,突变株166和167的Tn5插入位点基因编号分别为Aave-3192和Aave-2108。为了进一步明确这2个基因的功能,分别对这2个基因进行互补。生物学试验结果表明,互补菌株恢复对西瓜果实的致病性,且在游动性、群体感应、胞外多糖、生物膜等性状上部分恢复至野生菌株A13的水平,表明这2个基因与该病菌在西瓜上的致病性相关。     

Ac/Ds转座子系统及其在玉米突变体库构建中的应用

Ac/Ds转座子系统是研究玉米功能基因组学的重要工具。Ac/Ds转座子系统以其在基因组中的低拷贝、倾向插入基因外显子、可以在同一基因不同位点造成突变等独特优势,在构建玉米突变体库和进行基因功能鉴定方面具有重要应用前景。综述了Ac/Ds转座子系统的插入特点、转座机制、在玉米突变体库构建中的应用以及我国玉米突变体库的现状,并对我国玉米Ac/Ds突变体库的研究提出展望。     

马铃薯薯形突变体T-DNA插入侧翼序列分析

以‘鄂马铃薯3号’为材料,通过试管薯快速转基因技术获得一个编号为pCL2b-2薯形突变系,本研究通过表型鉴定、侧翼序列扩增和生物信息学等方法对其进行了研究,目的是分析该突变株表型变化控制机制。结果表明,该突变体的试管薯和温室收获块茎长宽比在p<0.05水平均显著大于野生型受体薯,其中试管薯长宽比为1.78,野生型试管薯长宽比为1.33;温室收获块茎长宽比为1.50,野生型块茎为1.29;利用hiTAIL-PCR技术对T-DNA插入位点两侧的侧翼序列分析表明,T-DNA插入编码异戊烯基转移酶(IPT)基因内部,该基因为细胞分裂素合成酶基因(StIPT),暗示StIPT基因可能参与马铃薯薯形发育。     

水稻T DNA插入雄配子不育突变体的创建

 对6000多个转基因T DNA插入水稻株系进行异常遗传分离分析（选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因hpt）,发现216个转基因株系的T DNA呈现1∶1分离。接着利用测交方法检测T DNA的遗传规律,初步确定其中57 个候选株系为雄配子不育候选突变体。随后对候选突变株进行多代遗传分析及花粉细胞学观察,结果表明其中的38个突变体花粉黑染率约为50％,自交后代T DNA的异常分离是由于转基因植株的花粉半不育所致,T DNA的传递只能通过雌配子体。另外,利用ELISA定量测定突变体中cry1Ac(Bt)基因编码蛋白的表达量,发现花粉的这种不育性与外源基因的表达量之间没有直接关系,推测这38个雄配子突变体败育的原因主要是T DNA插入引起内源基因变异。TAIL PCR 获得了22个水稻雄配子不育T DNA 插入突变体的侧翼序列,通过BLAST检索,定位了15个不同的插入位点,其中12个插入位点位于基因区或基因调控区。     

橡胶树胶胞炭疽菌T-900突变体生物学研究及其假定基因LV1敲除载体构建

从构建的橡胶树胶孢炭疽菌RC178(Colletotrichum gloeosporioides)突变体库中筛选获得一株致病力明显减弱突变体T-900,与野生菌株相比其菌落生长速率、产孢能力,孢子萌发率及附着孢形成率均明显降低。通过对突变菌株T-900 T-DNA侧翼序列克隆、比对和基因预测结果表明外源片段的插入破坏了一个预测基因的功能,该基因和组蛋白H3同源性为99%,暂命名为LV1。通过同源臂克隆构建了该基因敲除载体900-1A-900-1B-p CT74,为进一步研究该基因在病原菌致病过程中的作用机理提供了基础。     

鲜水中Bt菌株的分离及其生物学特性分析

以武夷山和福州森林公园采集获得的30份新鲜水样为材料,分离获得5株苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)野生菌株.为了解这些新菌株的生物学特性,进行了形态学、生理生化、杀虫晶体蛋白等研究,并对白纹伊蚊(A edes albopictus)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)两类靶标昆虫进行毒力测定,结果显示LLW1对白纹伊蚊有较高的杀虫活性,其较正死亡率可达95.5％.经PCR扩增,发现该菌株含有cty2基因.但这5个野生菌株对棉铃虫均无活性.     

甘蔗镰孢菌插入突变体库的构建、致病变异突变体筛选及突变基因定位

由镰孢菌复合种引起的甘蔗梢腐病（pokkah boeng disease, PBD）是甘蔗的主要病害之一。在广西,甘蔗镰孢菌（Fusarium sacchari）是PBD的优势病原菌。尽管PBD的研究已有较长的历史,但甘蔗镰孢菌的致病分子机理远未得到阐明。为研究甘蔗镰孢菌的致病分子机理,本研究采用农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）技术构建甘蔗镰孢菌FF001菌株的T-DNA插入突变体库。采用携带潮霉素B磷酸转移酶基因pTHR1-AH双元载体的农杆菌菌株AGL-1介导转化F. sacchari分生孢子,获得3018个转化子;随机选取12个转化子进行PCR检测和Southern杂交分析,结果显示所有检测突变株均插入潮霉素B磷酸转移酶基因,多数为单拷贝插入。采用离体叶片接种评价转化子的致病力,获得致病力明显减弱21个和致病力增强9个,共30个突变体。通过TAIL-PCR扩增测序并与甘蔗镰孢菌基因组序列比对,确定了其中27个突变株的T-DNA插入位点。观察到多个插入位点伴随有基因组片段缺失,导致1...     

稻曲病菌T-DNA插入突变体B1464插入位点分析

以稻曲病菌致病力丧失的突变菌株B1464为材料,对其生物学形态和分子遗传变异进行分析。B1464田间接种表现为不致病,与野生型菌株相比,在营养贫瘠的MM培养基上生长速率没有显著差异,而在PSA和TB3培养基中生长速率较慢,并且在PS液体培养基中产孢能力下降,同时突变菌株的分生孢子与野生型相比形态和大小均发生变化。Southern杂交结果显示T-DNA在突变菌株B1464中以单拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增得到的紧邻T-DNA两侧的侧翼序列在野生型中不相邻,与野生型菌株基因组比对发现突变菌株插入位点处丢失约20kb的DNA片段。RT-PCR结果表明突变菌株中T-DNA插入位点两侧基因表达量均下调。推断突变菌株B1464的致病能力丧失可能是由于T-DNA的插入导致了染色体重排及破坏了某些基因的正常表达。     

大豆转座子的研究现状及应用前景

大豆基因组中约有5万基因,大部分基因的功能处于未知状态。转座子插入突变体库的应用可以为解码大豆基因组中未知基因的功能提供研究平台,同时,也可以为创建有育种应用价值的大豆突变体种质资源库提供基础。大豆基因组中50%~60%的组分为转座子,其中具有活性的且结构完整的转座子只有Tgm9。大豆转座子突变体库目前主要还是利用外源转座子来建立,但是开发并改进内源转座子,增加其跳跃能力及稳定性,可以成为构建突变体库的一个新方向。本文主要介绍了大豆基因组中发现的各种转座子及其特点,并且重点讨论了外源转座子和大豆内源转座子在大豆突变体库创建中的应用现状及应用前景。     

玉米Mutator转座子结构特征和基因克隆的研究进展

Mutator（Mu）转座子是已发现的植物中转座活性最强的转座子,其较高的转座频率以及趋向于插入单拷贝功能基因转座的特性,使其成为构建玉米突变体库的一个主要方法。当前玉米B73品系基因组测序已经基本完成,利用反向遗传学方法,研究玉米基因的功能更为方便。文中简要介绍Mu转座子的结构特征以及Mu的分类,介绍3种克隆Mu转座子标签插入位点侧翼序列的技术,对Mu研究所存在的问题进行分析,展望Mu的应用。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻反光敏不育基因csa突变体的获得

利用CRISPR/Cas9技术,以反光敏育性基因CSA为编辑对象,构建了敲除载体pCAMBIA1301-Cas9-CSA-gRNA,用农杆菌介导法转化粳稻WG07,并分析CSA基因的突变类型。T0代转基因苗中有56株CSA突变单株,其中7株为纯合突变,纯合突变类型包括单碱基A、T和G的插入以及1个和3个碱基的缺失。长沙大田种植表明,短日照条件下,T1代无选择标记基因的csa突变体的花粉为完全不育;csa突变体的株高比野生型明显降低,分蘖数与野生型相比明显增加,而穗长与野生型相比无显著差异。粳稻csa突变体的获得为培育粳稻反光敏不育新种质奠定了材料基础。     

苎麻再生体系的建立及抗虫转基因苎麻的获得

建立了以下胚轴切段为外植体的高效苎麻再生体系,并通过农杆菌介导法将Bt毒蛋白基因导入到苎麻体内,获得了16株独立来源的转化植株.经点杂交分析和PCR-Southern分析,结果表明有 12株苎麻转化植株的基因组中整合有外源Bt基因.     

稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析

以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。     

油菜菌核病菌抗腐霉利菌株的生理生化特性及抗药机制初步分析

通过室内紫外线和药剂诱导,获得多株高抗腐霉利油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)突变体。与野生亲本菌株相比,抗性突变株(EC50800μg/mL)在高糖(40g/L蔗糖)和高盐(5g/LNaCl)培养基上生长缓慢,表明对高渗透压比较敏感;菌丝相对电导率较高,显示细胞膜透性增大,胞内电解质渗出较多。试验还发现,在含药培养液中,亲本菌株菌丝内甘油大量合成和积累,增加462.45%,而抗药突变株甘油含量仅稍有增加或有所下降,说明抗腐霉利突变株对外界渗透压的调节能力较低。根据已报道组氨酸激酶(HK)基因序列设计特异引物,经PCR扩增和测序,获得油菜菌核病菌HK基因保守区域序列1605bp。抗、感腐霉利菌株HK基因保守区域在第45位、第81位和第625位碱基不同,但编码的氨基酸一致。因此,油菜菌核病菌对腐霉利的抗性及抗药菌株的高渗敏感性与HK基因保守区域碱基突变无关。     

苎麻再生体系的建立及抗虫转基因苎麻的获得

建立了以下胚轴切段为外植体的高效苎麻再生体系，并通过农杆菌介导法将Bt毒蛋白基因导入到苎麻体内，获得了16株独立来源的转化植株。经点杂交分析和PCR-Southem分析，结果表明有12株苎麻转化植株的基因组中整合有外源Bt基因。     

新疆地区转Bt基因棉田主要害虫及其天敌消长规律的初步研究

对转Bt基因棉田与常规棉田主要害虫及天敌消长规律的研究结果表明,转Bt基因棉对棉铃虫有良好抗性,棉铃虫在转Bt基因棉田的落卵量与常规棉田落卵量差异不显著;田间幼虫存活虫量差异显著;田间越冬蛹基数差异极显著;田间蚜量转Bt基因棉田略高于常规棉田;田间优势天敌存量相当.     

农杆菌介导法将Bt(cryⅠA)基因导入大豆的研究

构建含有Bt(cry Ⅰ A)基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Bt,以大豆子叶节为受体,通过农杆菌介导法将Bt基因导人大豆品种黑农37中,获得转基因植株.并进行人豆的再生和遗传转化系统优化的研究,以获得较高的转化率.结果表明:在6-BA浓度为1.7 mg·L-1时,丛生芽分化率最高,确定该品种大豆在从生芽分化阶段的草铵膦筛选浓度为3.5 mg·L-1获得转化质粒pCAMBIA3300-Bt的转基因植株,其中T1代PCR阳性植株19株.采用real-time PCR的方法对T1代抗性植株进行Bt基因的转录水平的分析,初步证明Bt基因已整合到受体大豆的基因组内.     

转Bt基因棉花核质不育系自然昆虫研究与进展传粉杂交制种初探

在自然昆虫传粉条件下 ,研究了 6对转 Bt基因棉、6对常规棉核质不育系及相应同核异质保持系的主要性状 ,结果表明 :1 2对核质不育系与其同核异质保持系的株高、果枝数差异不显著 ;不育系的单株成铃、衣分、霜前子、皮棉产量极显著低于保持系 ,子指显著高于保持系。单铃重和霜前种子产量的表现有所不同 :转 Bt基因棉不育系的单铃重显著低于保持系 ,霜前种子产量没有明显差异 ;常规棉不育系的单铃重显著高于其保持系 ,霜前种子产量极显著低于保持系     

甘蓝型油菜抗苯磺隆突变体ALS基因分析与SNP标记

为筛选新型甘蓝型油菜抗苯磺隆除草剂的等位基因特异分子标记,以EMS诱变的甘蓝型油菜中双9号M2群体(约30 000单株)为材料,通过苯磺隆喷药处理筛选到3株抗除草剂突变体(分别记为K1、K4、K5)。利用PCR技术克隆到抗性突变体相应的Bn ALS1、Bn ALS2、Bn ALS3基因,序列分析结果表明,K1和K4的Bn ALS3基因序列发生碱基突变,其中第+535位C碱基突变为T,导致其编码的Bn ALS3蛋白第197位氨基酸由Pro突变为Ser;而K5的Bn ALS1基因序列第+544位C突变为T,导致其编码的Bn ALS1蛋白发生了Pro197Ser的改变(均以拟南芥ALS氨基酸序列为准)。其中K5抗性位点Bn ALS1∶Pro197Ser的改变属于首次报道。基于突变的基因序列设计了8对等位基因特异性PCR引物组合,有6对能用于区分抗性突变体和野生型材料,其中可检测K5的Bn ALS1基因SNP位点的引物有2对,可检测K1、K4突变体Bn ALS3基因SNP位点的引物有4对。