剑麻斑马纹病菌EST-SSR标记开发与评价

剑麻斑马纹病是剑麻生产中具有破坏性的一种真菌病害。本研究从Gen Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest)中随机下载10 525条寄生疫霉EST序列,经过去冗余处理后得到5 519条无冗余EST。利用MISA(MIcro SAtellite identification tool)软件进行SSR发掘,从中共搜索到199个1~6碱基SSR,其中三核苷酸重复基元类型最多,共鉴定到55个,占SSR总数的27.6%;其次是二核苷酸重复基元类型和单核苷酸重复基元类型,分别鉴定到51和47个,各占所鉴定SSR总数的25.6%和23.6%。进一步分析表明,AG/CT二核苷酸重复基元类型为优势重复类型,占二核苷酸SSR总数的76.5%。而AAG/CTT和AGC/CTG 2个基元类型在三核苷酸中出现频率最多,分别为15和11次,分别占三核苷酸SSR总数的27.3%及20.0%。从鉴定的199个SSR中,选取含有SSR的合适区段设计了22对引物,并通过18个剑麻斑马纹病菌菌株的基因组DNA进行了评价,结果只有其中9对引物能从剑麻斑马纹病菌基因组DNA中有效扩增,其扩增移效率为40.9%。由此表明,利用此方法来开发剑麻斑马纹病菌的分子标记具有可行性,只是存在一个转移效率问题。     

咖啡叶锈病菌转录组SSR信息分析

咖啡叶锈病是咖啡一种毁灭性病害。利用GRAMENE网站提供的SSR鉴定工具SSRIT(Simple Sequence Repeat Identification Tool),对咖啡叶锈病菌8 310条无冗余的EST分别进行SSR鉴定。结果共搜查到1 292个1~6碱基SSR,出现频率最高的为三碱基重复基元类型,其次为二碱基重复基元类型与六碱基重复基元类型。分别为459、321与214个,其出现频率分别为35.5%、24.8%与16.6%。AT/AT为二核苷酸中优势重复类型,占其总数的49.8%;而ATC/ATG与AAG/CTT则为三核苷酸中优势重复类型,二者分别占三核苷酸SSR总数的23.5%与23.3%。进一步对SSR多态性进行了预测,从而筛选出长度在22 bp以上具有潜在多态性的SSR 223个。此结果对于咖啡叶锈病菌群体遗传变异、多样性和进化等研究提供了分子标记。     

大豆EST-SSR标记开发及与Genomic-SSR的比较研究*

本研究对458220条大豆EST序列进行SSR搜索,共检测出EST-SSR序列39989条, 经拼接得到无冗余EST-SSR序列8190条,包括357种重复基元。其中二、三核苷酸重复基元类型居多,分别占无冗余EST总数的11.13%和16%,统计得到二核苷酸重复类型12种,三核苷酸重复类型60种。以含有简单重复序列的无冗余EST序列设计200对引物,其中148对引物有清晰且单一条带扩增产物,以30份大豆品种资源进行引物筛选,获得多态性引物31对。以21份大豆不同基因型的基因组DNA为模板选取30对显示多态性的大豆EST-SSR引物和30对大豆基因组SSR引物进行扩增,带型统计结果显示：大豆EST-SSR与基因组SSR在供试基因型间多态性指数均值分别为0.55 和0.44,二者揭示的多态性水平差异不大。从而说明利用生物信息学方法基于大豆EST开发SSR标记是切实可行的,大豆EST-SSR可以用于大豆遗传多样性分析,是大豆DNA分子标记体系的一个重要补充。     

稻瘟病菌基因组中微卫星序列的频率和分布

 利用已经公布的稻瘟病菌基因组测序结果，对该植物病原真菌基因组中的微卫星（SSR）的类型、大小及分布进行了系统分析。在已经公布的37.89 Mb的基因组序列中，共有16 398个由1~6个核苷酸为基序的SSR序列（匹配值为80％），其总长度占整个基因组碱基数的0.87％，平均2.31 kb碱基中就分布有1个大于15 bp的SSR。其中数量最多的是单碱基重复，达到4 392个，其次为三碱基重复序列 （3 586个），五碱基重复序列（3 442个），这3种SSR总数达11 420个，占SSR的 69.7%。数量最少的是二碱基重复序列，只有680个。在整个基因组中的主要基序有A，AG，AC，ACG，AGC，AAG，GGC，ACCT，ATCC，AAAG，AAAAG，AAAAT，AAAAC，AAAAAG， AAAAAT和AACTAG。有的基序类型则完全没有出现。对不同超级连锁群的分析结果表明，各连锁群之间的SSR分布有一定差异，但总体上仍是较为均衡的。这些结果为稻瘟病菌的基因标记、群体结构研究、非编码区DNA序列的结构及功能研究提供了一个较好的基础。     

剑麻茎腐病菌的rDNA-ITS序列分析

应用核糖体rDNA-ITS区的序列分析研究13个不同地区来源的剑麻茎腐病菌,测序结果表明,参试菌株的ITS扩增区约600 bp,无太大的长度变异,同时通过在GenBank中搜索其同源性序列并构建它们的系统发育树,结果表明,引起剑麻茎腐病的病原为黑曲霉菌Aspergillus niger。     

木荷基因组 SSR 位点开发及初步分析

为开发木荷分子标记,采用高通量测序技术获得木荷基因组原始数据,经生物信息学软件对木荷基因组序列进行序列拼接、组装和对比,共获得 308 418 条 Contig 序列和 459 984 条 Scafford 序列。采用 MISA 软件搜索木荷基因组序列中微卫星（Microsatellite）位点,共得到 334 843 个 SSR 序列,总长度 5 074 708 bp,占木荷基因组大小的 0.98%,木荷基因组 SSR 序列平均长度为 15.2 bp,平均分布频率为 644 个/Mb。木荷 SSR 序列中,单核苷酸序列数量最多,共 188 217 个,占木荷 SSR 序列总数的 56.21%,其次是二核苷酸（23%）>三核苷酸（13%） >四核苷酸（5%）>五核苷酸（2%）>六核苷（1%）。木荷全基因组 SSR 序列中共包括 400 种重复基元,其中单核苷酸重复基元 A 和二核苷酸重复基元 AT 是主要重复基元,分别占总 SSR 的 56%和 11%,SSR 基元的重复次数分布在 4~40 次,主要分布在 4~25 次。本研究丰富了木荷分子标记类型,为进一步群体遗传结构和遗传多样性分析提供了基础数据。     

基于转录组测序的油梨 EST-SSR 引物开发

利用转录测序技术,开发油梨表达序列标签-简单重复序列（EST-SSRs）,为 SSR 标记在油梨种质资源鉴定、 品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础。采用 Illumina 二代测序的技术,共获得 37 639 条无冗余的序列,对其进行 SSR 搜索,共获得 6 419 条简单序列重复（SSR）。利用 Primer 3.0 软件设计 SSR 引物,并以 11 份油梨种质筛选多态性引物。 基于转录组序列开发出的 EST-SSR 的分布频率为 17.05%。在油梨 EST-SSR 中,单核苷、二核苷和三核苷的重复占主 导,占总数的 99.07%。单、二、三核苷酸重复单元分别占总 SSR 的 37.47%、31.80%和 29.80%;出现频率最高的二核 苷酸重复基元是 AG/CT,占总数的 29.15%,出现最高的三核苷酸重复基元为 AAG/CTT,占 12.01%。随机选择 315 个 SSR 位点合成引物,经 11 份油梨种质筛选鉴定,227 对引物可扩增获得产物,有效扩增率为 72.06%;其中 34 对引物 表现出良好多态性,占有效引物的 12.78%,占总引物的 10.79%。在 34 对多态性引物中,每对引物扩增等位基因数 2~12 个。利用高通量测序开发 SSR 引物有较好的实用性,开发获得的 34 个具有多态性的油梨 SSR 标记可用于研究油梨及 其相关近缘物种的遗传变异。     

基于转录组测序的油梨 EST-SSR 引物开发

利用转录测序技术,开发油梨表达序列标签-简单重复序列（EST-SSRs）,为 SSR 标记在油梨种质资源鉴定、品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础。采用 Illumina 二代测序的技术,共获得 37 639 条无冗余的序列,对其进行 SSR搜索,共获得 6 419 条简单序列重复（SSR）。利用 Primer 3.0 软件设计 SSR 引物,并以 11 份油梨种质筛选多态性引物。基于转录组序列开发出的 EST-SSR 的分布频率为 17.05%。在油梨 EST-SSR 中,单核苷、二核苷和三核苷的重复占主导,占总数的 99.07%。单、二、三核苷酸重复单元分别占总 SSR 的 37.47%、31.80%和 29.80%;出现频率最高的二核苷酸重复基元是 AG/CT,占总数的 29.15%,出现最高的三核苷酸重复基元为 AAG/CTT,占 12.01%。随机选择 315 个SSR 位点合成引物,经 11 份油梨种质筛选鉴定,227 对引物可扩增获得产物,有效扩增率为 72.06%;其中 34 对引物表现出良好多态性,占有效引物的 12.78%,占总引物的 10.79%。在 34 对多态性引物中,每对引物扩增等位基因数 2~12个。利用高通量测序开发 SSR 引物有较好的实性,开发获得的 34 个具有多态性的油梨 SSR 标记可用于研究油梨及其相关近缘物种的遗传变异。     

基于甘蔗AP85-441和R570基因组参考序列的微卫星位点鉴定和SSR标记开发

分子标记缺乏是制约甘蔗分子标记技术发展的重要因素。本研究利用甘蔗AP85-441和R570基因组参考序列,使用MISA软件分别鉴定出512 835和97 839个微卫星位点,分别占割手密基因组（AP85-441）和甘蔗基因组（R570）高质量参考序列的0.32%和0.35%。在2个基因组序列中,优势重复单元均为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,各重复单元均以AT富集的基元为主。割手密和甘蔗基因组序列中分别有472 117和89 748个位点可以开发SSR标记。对割手密、甘蔗与高粱基因进行同源性分析,分别鉴定出16 691个和13 271个对应到高粱1~10号染色体上的同源基因,利用基因序列中的SSR位点,开发出13 224和7624对SSR引物。对开发的引物分别以割手密和甘蔗基因组为模板进行e-PCR检测,这些引物在割手密基因组中以多位点扩增为主,在2个基因组中的有效标记比例分别为79.35%和36.13%、79.01%和93.36%。部分SSR引物在基因组中表现出特异性扩增,有1368对仅在AP85-441中单扩增,有1420对仅在R570序列中单扩增,共有752对SSR引物可在2个基因组中单扩增,且这些SSR的扩增位点和来源基因均分布于所在基因组的全部染色体上。在禾本科作物基因组中e-PCR检测表明,开发的单扩增SSR标记具有较好的特异性。本研究鉴定的SSR位点,有助于进一步丰富甘蔗的分子标记;开发的3540对SSR引物对于栽培种甘蔗遗传图谱构建中遗传来源区分和同源连锁群确定具有重要的参考意义。     

青稞转录组SSR位点及其基因功能分析

为了探讨青稞转录中SSR位点信息及其所在基因的生物学功能,使用MISA软件分析青稞转录组中SSR的分布频率和重复基元的基本类型,通过BLASTX对含有SSR的Unigene与nr、COG、Swiss-Prot和KEGG等公共数据库进行比对和功能注释。结果表明,在青稞转录组拼接得到的58 065个Unigene中发现9 576条序列中含有11 930个SSR位点,SSR发生频率为16.49%,平均每6.63kb出现1个SSR位点,共有119种重复基元(motif)。青稞转录组SSR出现频率最高的是三核苷酸重复基元(64.19%),其次是二核苷酸重复基元(24.05%)。AG/CT和AGG/CCT、CCG/CGG、AGC/CTG分别是二核苷酸重复和三核苷酸重复中的优势重复基元。在转录组中SSR重复次数以5~12次为主,基序长度主要集中在12~25bp,平均长度为21.15bp。9 576个含SSR的Unigene与nr、COG、Swiss-Prot和KEGG等公共数据库进行BLASTX比对,分别得到7 987、5 559、5 588和2 077个注释。通过基因功能注释发现青稞转录组中含SSR的序列主要与生物的基础代谢相关。     

基于转录组的剑麻SSR标记开发与筛选

本研究基于剑麻转录组测序获得的70110条Unigene序列,采用MISA 1.0软件查找SSR位点,利用Primer 3.0设计SSR引物,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其中的100对SSR引物有效性进行验证.总计获得了13175个SSR位点,SSR的分布频率为15.61％.70110条Unigene序列总计包括60种...     

SSR分子标记在玉米杂种优势群划分中的应用

利用SSR标记研究了20个玉米自交系的遗传变异,初步进行了杂种优势群划分,从85对SSR引物中筛选出70对扩增产物具有稳定多态性的引物.70对引物在供试材料中共检测出270个等位基因变异,每对引物检测到等位基因2～6个,平均3.86个,多态性信息含量变化范围为0.26～0.80,平均多态性信息量为0.59.20个自交系之间的遗传相似系数变化范围为0.5946～0.7711,平均为0.6601.UPGMA聚类分析结果表明,供试自交系可分为5群,分类结果与系谱基本一致,划群后群间平均距离大于群内平均距离,群间平均产量大于群内平均产量.SSR标记可以进行玉米自交系遗传变异分析,并用于杂种优势群的划分。     

芒果转录组中SSR位点信息分析与引物筛选

利用MicroSAtellite软件分析筛选芒果转录组中的SSR位点。结果表明,在54 207条Unigene中共搜索得到4 103个SSR位点,出现频率为7.57％。其中,三核苷酸重复为主导重复类型,占SSR总数的38.19％,其次是单核苷酸重复（26.91％）。AG/CT和AAG/CTT分别是二核苷酸和三核苷酸重复的优势基元。根据SSR侧翼序列共设计6 915对SSR引物,随机挑选了230对进行PCR检测,获得93对多态性引物。由此可见,芒果转录组数据可以作为大量开发SSR标记的资源,这些SSR标记也将有助于芒果遗传多样性和种质资源鉴定的研究。     

11种热带植物EST-SSR标记的开发和多样性分析

对11种热带植物的640 863条表达序列标签（ESTs）进行分析，发掘出13 916个EST-SSR位点，平均分布频率约为109.37个/Mb，主要特点表现为：（1）不同物种间的EST-SSR丰度存在明显差异，其中菠萝EST-SSR位点最为丰富（201.75个/Mb）；芒果EST-SSR位点丰度最低（49.55个/Mb）；（2）二、三核苷酸基元的SSR最为常见，两者占总数的88.68％。其中，AG/CT、AT/AT和AAG/CTT在不同基因组区域都是占优势的SSR类型；（3）SSR在基因组不同区域分布丰度存在很大差异。其中，麻疯树基因组SSR（gSSR）的丰度是EST-SSR丰度的17倍多；（4）保守基因内AG/CT重复的SSR极其丰富。此外，设计了一批具有物种特异性的EST-SSR PCR引物。     

Large scale identification of SSR marker in perilla by next generation sequencing

Perilla frutescens (L.) is an edible, medicinal crop, and most popular in East Asia. Its molecular breeding and research are hampered by the paucity of molecular markers. Simple sequence repeat (SSR) markers are ubiquitous and widely used in eukaryotic genomes. EST-SSRs identification of perilla was performed in 116,387 reads generated by Illumina paired-end sequencing technology. In total 25,449 unigenes containing SSR and 33,867 SSR loci were identified, and 19,400 primer pairs were designed. Polymorphism of SSR primers was conducted by searching for insertions and deletions (INDELs), and 1,567 unique SSRs were predicted. Totally, 200 SSR primer pairs were selected for polymorphic validation among 23 perilla accessions. Results showed that 175 primer pairs produced amplicons, and 30 pairs exhibited polymorphism. Polymorphic ratio was higher by using INDEL method than using conventional primers. Phylogenetic analysis showed the 2 distinct groups: P. frutescens var. frutescens and P. frutescens var. crispa. Wrinkled leaf trait and seed trait were distinct between these 2 groups. However, no clear leaf color or geographic relationship was detected. The large scale development and identification of SSR marker in this research laid a foundation for genetic analysis and marker assisted breeding of cultivated perilla.     

Identification of EST–SSRs and molecular diversity analysis in Mentha piperita

EST sequences of Mentha piperita available in the public domain(NCBI) were exploited to develop SSR markers. A total of 1316 ESTs were assembled into 155 contigs and 653 singletons and of these, 110 sequences were found to contain 130 SSRs, with a frequency of1 SSR/3.4 kb. Dinucleotide repeat SSRs were most frequent(72.3%) with the AG/CT(43.8%)repeat motif followed by AT/AT(16.2%). Primers were successfully designed for 68SSR-containing sequences(62.0%). The 68 primers amplified 13 accessions of M. piperita and 54 produced clear amplicons of the expected size. Of these 54, 33(61%) were found to be polymorphic among M. piperita accessions, showing from 2 to 4 alleles with an average of2.33 alleles/SSR, and the polymorphic information content(PIC) value varied between 0.13 and 0.51(average 0.25). All the amplified SSRs showed transferability among four different species of Mentha, with a highest in Mentha arvensis(87.0%) and minimum in Mentha citrata(37.0%). The newly developed SSRs markers were found to be useful for diversity analysis, as they successfully differentiated among species and accessions of Mentha.     

巴西橡胶树TCTP基因结构分析及分子标记开发

翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumour protein,TCTP)是生物体中一种普遍存在且高度保守的蛋白.作为一种多功能蛋白,TCTP在各种复杂的生命活动中发挥重要作用.本研究根据已知的HbTCTP cDNA序列设计引物,对PCR扩增产物测序获得HbTCTP基因组序列.比对HbTCTP基因组和cDNA序列发现HbTCTP由4个内含子和5个外显子组成,内含子与外显子剪接处符合GT/AG法则.根据HbTCTP序列及基因结构信息开发简单重复序列(SSR)和内含子长度多态性(ILP)标记,并在10个橡胶树品系中分析SSR和ILP标记多态性.结果表明,SSR和ILP标记在10个橡胶树品系中均出现多态性,多态性分别由SSR重复次数多少和内含子长短引起.     

茶树EST-SSR的信息分析与标记建立

在1589条茶树EST中,共发掘出了281个EST-SSR,分布于246条EST中,出现频率是17.68%,平均长度为33.06βbp,平均分布频率是1/2.61βkb。在茶树EST-SSR中,二核苷酸重复是主要的重复类型,出现最多的重复基元类型是AG/CT重复。设计了19对SSR引物,在对引物、dNTP、MgCl₂的浓度及退火温度等参数进行测试后,建立了合适的PCR反应体系。以衍生绝大多数EST-SSR的龙井43βDNA为模板,对引物进行了筛选,有16对引物显示扩增,可用率为84.2%; 进一步在10个茶树品种中进行多态性测试,显现出多态性的引物占可扩增引物的62.5%。本文研究结果证明了根据茶树EST建立SSR标记是有效、可行的。