小麦谷氨酰胺合成酶基因可变剪接分析

谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是植物氮素同化的关键酶,小麦(Triticum aestivum L.) GS由12个核基因编码,即TaGS1;1-6A/6B/6D、TaGS1;2-4A/4B/4D、TaGS1;3-4A/4B/4D和TaGS2-2A/2B/2D。利用单分子测序技术获得了TaGS基因的全长转录本,发现TaGS1;1-6A有1种可变剪接转录本、TaGS1;1-6B有2种可变剪接形式;与正常转录本编码的TaGS相比,TaGS1;1-6A-1的Gln_synt_N结构域部分缺失,TaGS1;1-6B-3缺少Gln_synth_gly_rich_site结构域;TaGS1;1-6B-4是新鉴定的转录本,编码缺少Gln_synth_gly_rich_site和Gln_synth_cat_do...     

甜菜谷氨酰胺合成酶基因在不同氮素条件下的表达分析

采用半定量RT-PCR技术对甜菜胞液型谷氨酰胺合成酶（GS1）和质体型谷氨酰胺合成酶（GS2）基因进行mRNA的表达检测,同时进行谷氨酰胺合成酶活性的测定,研究不同氮素处理对谷氨酰胺合成酶（GS）基因表达的调控,并以三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照进行基因表达水平的半定量分析。结果显示,NO3^-：NH4^＋〉1和NO3^-：NH4^＋=50：50较NO33^-：NH4^＋〈1更能促进GS活性;NO33^-：NH4^＋=80：20和NO3^-：NH4^＋=50：50较NO3^-：NH4^＋〈1更能促进GSI基因的表达;NO3^-：NH4^＋〉1和NO3^-：NH4^＋=50：50较NO3^-：NH4^＋〈1更能促进GS2基因的表达。说明硝态氮比例较高的混合态氮较铵态氮比例较高的混合态氮及单一铵态氮更能促进GS活性和GS基因的表达,氮素能有效地在转录水平上调控甜菜幼苗叶片GS基因的表达。     

小麦耐盐相关基因TaSTK的克隆

利用RACE方法,从小麦耐盐突变体RH8706-49中扩增获得小麦丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Triticum aestivum serine-threonine protein kinase）基因TaSTK的全长cDNA序列,含1 958 bp,其中开放阅读框1 431 bp,编码476个氨基酸。其编码区基因组DNA全长为4 095 bp,含5个外显子。该基因的全长cDNA序列及基因组序列均已提交GenBank数据库（登录号：DQ103756和DQ341377）。经过NCBI比对发现该基因的氨基酸序列与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶都具有较高的同源性。Northern杂交检测表明,TaSTK在小麦中属于盐诱导增强型基因,并且在耐盐材料RH8706-49中诱导增强程度高于敏盐材料H8706-34。TaSTK的杂交信号非常弱,表明TaSTK在小麦幼苗的叶片组织中属于低表达的基因类型。     

小麦盐胁迫相关基因TaMYB32的克隆与分析

在对小麦全长cDNA克隆进行大规模测序及转录因子功能研究中,筛选到一个盐胁迫相关的MYB转录因子基因,将其命名为TaMYB32。TaMYB32的全长cDNA序列为1250 bp,开放阅读框为732 bp,编码一个具有244个氨基酸的R2R3-MYB转录因子。根据该基因的cDNA序列设计引物,分别在小麦二倍体祖先种乌拉尔图小麦UR206、拟斯卑尔脱山羊草Y2006和粗山羊草Y2282以及六倍体普通小麦中国春和茶淀红中克隆了TaMYB32的基因组和cDNA序列。序列分析表明TaMYB32在小麦二倍体祖先种中存在2种序列,在六倍体小麦中存在4种序列,其中1种序列在进化上非常保守,在二倍体和六倍体中完全相同。对TaMYB32的基因组和cDNA序列比较分析表明它是一个没有内含子的基因。电子定位发现TaMYB32在小麦第六同源群上,每个基因组中有2个拷贝,这与测序结果相吻合。同源序列分析发现,TaMYB32与来自水稻和玉米中的MYB蛋白的相似性分别为72.4 %和73.7%。组织表达特性分析表明该基因在小麦根、茎、叶、雌蕊和花药中均有较强的表达。半定量与实时定量RT-PCR结果表明TaMYB32是一个受盐胁迫诱导表达的基因。     

西葫芦种皮纤维素合成酶基因CpCesA的克隆及表达分析

裸仁西葫芦因其种皮退化无需脱壳而备受关注,纤维素是植物细胞壁的主要组成成分,是影响西葫芦种皮形成的重要因素,而纤维素合成酶(CES)在植物纤维素合成过程中起关键作用。为深入探究西葫芦CpCesA基因对种皮形成的调控机制,本研究通过克隆获得CpCesA的基因序列,利用生物信息学方法分析其结构和编码蛋白的理化性质。利用实时荧光定量PCR检测种皮不同发育时期和西葫芦不同组织部位CpCesA的表达模式。通过克隆获得CpCesA开放阅读框序列全长2 952 bp,生物信息学分析表明,其编码的蛋白质在葫芦科作物中有很强的保守性,且具有纤维素合成酶家族蛋白的保守结构域,属于质膜蛋白。实时荧光定量PCR结果显示：在种子发育过程中,Cp Ces A在裸仁西葫芦种皮中的表达量比有壳西葫芦普遍显著偏低,有壳西葫芦在授粉后10 d CpCesA表达量达到最高,而裸仁西葫芦则在授粉后20 d达到最高后开始下降。不同品种种皮发育相同时期、同一品种不同发育时期Cp CesA表达量表现均不同,这表明CpCesA与西葫芦种皮的发育和形成有着密切关系。组织表达分析表明,Cp CesA在两种西葫芦叶片、茎、根、花瓣等不同组...     

花生蔗糖合成酶基因的克隆及序列分析

蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶,在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要作用。为揭示蔗糖合成酶基因在花生中的抗逆机理,以花生基因组DNA为模板,利用染色体步移技术(GenomeWalking)中的TAIL-PCR技术扩增花生SuSy基因组序列和启动子区域,得到基因组序列6 189 bp,启动子预测分析表明,该序列包含约800 bp的启动子上游调控序列,13个外显子,12个内含子。启动子元件分析显示,该片段含有典型的TATA-box、CAAT-box,并存在低温响应元件LTR、GA响应元件、干旱响应MYB结合位点、厌氧诱导必要的顺式作用元件ARE等调控元件,及G-box、box4等光响应元件,说明花生SuSy基因的表达可能受低温、干旱、缺氧、光照等环境因素以及激素GA的调控。     

野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及功能分析

干旱、盐碱和低温等非生物逆境是危害作物诸多因素中最为严重的自然灾害, 它可以使作物减产, 甚至死亡。目前通过生物技术手段获得可利用的抗性基因是提高植物抗性的重要途径。东北野生大豆具有丰富的基因资源, 是基因克隆的理想材料。从低温(4℃)、干旱(30%PEG)及盐胁迫(200 mmol L^-1NaCl)处理的东北野生大豆幼苗叶片中提取总RNA, 经反转录合成cDNA第一链, 并以此链为模板, 从已构建的盐胁迫全长cDNA文库和东北野生大豆盐胁迫EST数据库中筛选出与渗透胁迫直接相关的EST序列, 根据该序列设计一对PCR引物扩增S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因的全长序列, 经Blast比较分析, 确定所获得的SAMS基因全长序列。构建以pBI121为基础的CaMV35S启动子调控的植物表达载体; 利用农杆菌介导法将其导入烟草, 获得了180株转基因烟草, 并进行了低温、干旱和盐胁迫处理, 通过测定在不同胁迫处理下的生理指标, 分析了基因的功能。野生大豆的SAMS基因在烟草中的超量表达提高了转基因烟草的抗低温、干旱和耐盐能力。     

小麦(Triticum aestivum)蔗糖关键合成酶基因TaSPP2克隆与结构分析

磷酸蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphate phosphatase,SPP)是蔗糖合成最后步骤的关键酶,在参与小麦(Triticum aestivum)蔗糖代谢转运和籽粒灌浆中起重要作用。为了在基因组DNA水平上揭示小麦SPP酶基因的结构特征,预测该基因所编码蛋白特性,本研究通过克隆小麦SPP酶全长基因,利用生物信息学方法,从基因结构、理化特性、进化关系、亚细胞定位、跨膜结构和二级结构等方面对该基因进行了预测和分析。结果表明:通过克隆、测序和拼接,获得小麦磷酸蔗糖磷酸化酶基因(TaSPP2),该基因全长2865 bp,包含8个外显子区和7个内含子区,被定位在小麦D基因组上。TaSPP2与粗山羊草(Aegilops tauschii)亲缘关系最近。该基因编码的蛋白分子量为47.19 kD,等电点为6.04,含有38处磷酸化位点,不含跨膜区,属于非分泌型亲水胞内蛋白。二级结构以无规则卷曲为主(45.02%),其次是α-螺旋占和延长链,无β-转角。本研究结果将为进一步验证和解析小麦TaSPP2基因的功能提供理论依据。     

不同供氮条件下谷氨酰胺合成酶与谷氨酸合成酶对油菜氮素再利用的影响

为了探究不同供氮水平下氮素利用相关酶的贡献程度,采用单株砂培培养,严格控制氮素等营养供应,用15N饲喂追踪。研究了氮高效油菜品系742谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)交替抑制情况下,油菜的子粒氮素转运和积累量、氮素损失的情况以及对氮素利用率的影响。结果表明,氮胁迫与正常供氮2种情况下,在抑制GOGAT活性时,氮素利用效率最低,子粒中氮素转运比例最低,氮素损失最大,在抑制GS时影响较小。缺氮时GOGAT对子粒氮素积累、作物产量形成及作物体内氮素再利用影响很大,GS影响较小。同时发现在生育后期,正常供氮与氮胁迫2种情况下子粒中来源于营养器官前期积累的氮素达到50%⁷0%。油菜营养器官生育前期积累的氮素主要用于氮素再利用,子粒中积累的氮素大部分来源于营养器官。     

酸枣肌醇半乳糖苷合成酶ZjGolS2基因的克隆及表达分析

肌醇半乳糖苷合成酶是催化棉子糖系列寡糖合成的关键酶,在植物抗逆生理过程中具有重要作用.本研究根据酸枣高温胁迫转录组数据,成功从酸枣幼苗叶片中克隆到1个肌醇半乳糖苷合成酶基因ZjGolS2,包含一个1 017 bp的开放阅读框,编码338个氨基酸,蛋白分子量为38.82kD,GenBank登录号为XM_016044622...     

小麦淀粉GBSSⅡ基因的克隆、反义和RNAi载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号籽粒中克隆出颗粒型淀粉合成酶Ⅱ基因(Granule bound starch synthase,GBSSⅡ)部分cDNA片段(1 069 bp)(GenBank 登录号:EF221764),同源性比较结果显示,它与GenBank 上已报道的GBSSⅡ基因有高度的同源性.以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的GBSSⅡ基因的反义表达载体pWM101GBSSⅡA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了GBSSⅡ基因的RNAi载体pFGC5941GBSSⅡsa,这些载体的构建为研究GBSSⅡ基因的功能打下了很好的基础.     

小麦TaHPPR基因的克隆与表达分析

为研究羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)在小麦逆境胁迫中的作用,本研究利用同源克隆法获得1个小麦HPPR基因,命名为TaHPPR,并对其组织表达特性和逆境胁迫表达特性进行了分析.以'太原806'、'小白麦'、'京冬8'及'京411'为供试材料,用荧光定量方法获得组织表达和逆境胁迫表达数据.序列分析表明:TaHPPR基因含有...     

小麦光敏色素基因TaPhyB3的克隆和表达分析

从小麦品种中国春中克隆了编码光敏色素基因B的脱辅基蛋白,将其定位于4D染色体的长臂上,并命名为TaPhyB3。TaPhyB3的开放阅读框为3501bp,编码一个128kD、具有1165个氨基酸的蛋白质。它与水稻、玉米和拟南芥在氨基酸水平上的一致性分别为93%、90%和73%。对不同光线处理7d小麦植株表达的分析表明,TaPhyB3在黑暗中表达最低、在白光下的表达水平最高,在远红光、红光、蓝光和白光下的表达水平分别是黑暗中的2.2、7.7、7.4和37.3倍。组织特异性表达分析表明,TaPhyB3在小麦幼苗所有组织中都表达,叶片中的表达水平是根的11.4倍。推测TaPhyB3的表达水平与小麦的光形态建成的程度呈正相关。     

Rht12矮秆小麦GA3ox基因的克隆与表达分析

赤霉素3-氧化酶(GA3ox)是赤霉素生物合成途径中的一种关键酶,在茎的伸长中起着重要的作用。为探讨GA3ox基因和Rht12矮秆小麦矮化之间的关系,本研究利用同源克隆方法分离得到了小麦品种中国春和宁98-2105(含矮秆基因Rht12)的GA3ox1和GA3ox2基因,并对其在茎的不同部位进行了表达模式分析。研究结果表明,小麦GA3ox1和GA3ox2均含有3个外显子和2个内含子,其编码的蛋白具有2-酮戊二酸依赖性的双加氧酶典型的保守结构域,但中国春和宁98-2105的GA3ox1和GA3ox2之间存在部分碱基的差异。实时定量表达分析结果显示,GA3ox1和GA3ox2在中国春和宁98-2105茎的不同部位的表达趋势基本一致,但表达量具有较大差异,GA3ox1和GA3ox2在宁98-2105茎的倒一节结节中的转录水平显著高于中国春,推测宁98-2105中赤霉素的信号转导通路可能受到了影响,即矮秆基因Rht12可能影响了赤霉素信号的传导。本研究结果为进一步研究矮秆基因Rht12的致矮机理和利用提供了理论依据。     

异附加系小麦过氧化物还原酶基因TaPrxQ的克隆与序列分析

本研究依据消减结果克隆得到山农6306编码过氧化物还原酶TaPrxQ的cDNA序列,利用生物信息学工具对其核酸和蛋白序列进行分析。结果表明克隆得到的TaPrxQ序列与基因组DNA对比分析得到的该基因不含有内含子,全长943bp。TaPrxQ的cDNA序列包含927bp的开放阅读框,编码308个氨基酸残基,其等电点为9.41,分子量32.4kDa。相似性比对分析显示TaPrxQ同已报道的HvPrx的氨基酸序列具相似性达到88%,从进化树分析结果推断TaPrxQ属于PrxQ类。     

富有柿果实ACC合成酶3′末端的cDNA克隆

利用3’RACE的方法对柿果实ACC合成酶基因的3’末端进行扩增,扩增产物克隆到pMD18－T Vector载体上,转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a,蓝白斑筛选重组质粒,并对插入片段进行序列测定。结果表明,3’RACE产物长912bp,开放阅读框内核苷酸序列编码251个氨基酸,此氨基酸序列含有ACC合成酶中3个高度保守区,GenBank中登录的DK－ACS1（登录号AB073005）序列只有一个的氨基酸不同。终止子后面的3’非编码区的长度为155bp,其中只有一个核苷酸与DK—ACS1的3’序列非编码区不同。序列分析结果显示,克隆的片段含有5’端GSP Inner Primer和3’端为RACE Inner Primer的引物。     

谷氨酰胺合成酶产酶菌株的筛选及酶学性质

通过对枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉3种菌株的筛选,得到3种菌株具有产谷氨酰胺合成酶(GS)的能力,其中米曲霉产酶能力较高,对米曲霉菌株进行紫外线诱变使其产酶能力提高了15.6%。确定了米曲霉最佳超声波破碎条件为:功率400W,工作1s,间歇3s,超声20min。谷氨酰胺合成酶的最佳酶促反应时间为30min,最适pH值为6.5,最适温度为60℃,并且得出了Mg2+和Mn2+对维持酶活至关重要。     

小麦类钙调素TaCML79基因的克隆和表达分析

为了研究小麦类钙调素基因的功能和在植物逆境响应中的分子机制,以电子克隆结合RT-PCR的方法,在小麦中克隆到一个类钙调素基因TaCML79。该基因的开放阅读框长度为588bp,编码的蛋白长度为195个氨基酸,推测的分子量为20.45kDa,等电点为4.6,属于酸性蛋白,具有2个典型的和一个不完整的EF-hand结构域。多序列比对和系统进化树分析表明,TaCML79与野生稻的ObCML35和水稻的OsCML10亲缘关系较近,相似性分别为84.6%和86.8%。该基因的表达在根和地上部分受到热激、NaCl、渗透和冷胁迫的诱导或抑制,初步推断该基因可能与植物抗逆有密切的关系。