通过染色体整合几丁质酶基因提高伯克氏菌生防能力

为了提高伯克氏菌Burkholderia vietnamiensis的生防能力,通过Tn5转座子介导,将其携带的来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的几丁质酶基因整合到野生伯克氏菌B418染色体DNA上,获得工程菌株B418-37。对获得的转化子进行Southern杂交和几丁质酶活性检测,结果证实几丁质酶编码基因已整合到伯克氏菌B418-37染色体DNA上并能表达几丁质酶。生物学特性研究发现几丁质酶基因整合到伯克氏菌染色体中,没有影响野生菌的解磷、解钾、固氮及其在植物根际的定殖能力。平板抑菌试验和温室盆栽试验显示,与野生型相比,该工程菌株对多种病原真菌的抑菌效果增强,说明几丁质酶在植物病害的防治中具有重要作用。上述结果说明通过染色体整合几丁质酶基因是获得多功能生防工程菌的有效途径之一。     

枯草芽孢杆菌B-908几丁质酶基因的转化及表达

 水稻纹枯病是我国水稻上一大病害,目前主要靠施用井冈霉素来进行防治,但有迹象表明,病原菌似有抗药性变异出现。因此亟需一种无污染的替代药剂,以便交互使用,防止抗药性的发展。     

黄蓝状菌几丁质酶基因tfchi1的克隆、表达及抗菌活性

 为研究黄蓝状菌（Talaromyces flavus）几丁质酶性质和作用,通过RT PCR、3′ RACE及5′ TAIL PCR技术克隆了一个黄蓝状菌几丁质酶基因tfchi1,该基因全长为2 561 bp,含有6个内含子,包含一个1 194 bp的ORF,编码397个氨基酸,分子量为43.47 kDa,属于糖苷水解酶第18家族。利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体pPIC9K/tfchi1,并转化毕赤酵母,筛选得到一株高效表达几丁质酶的工程菌GS TFCHI1 9,甲醇诱导第7 d酶活性最高,达32.29 U·mL-1。SDS PAGE检测纯化重组蛋白的分子量约44 kDa。重组几丁质酶Tfchi1最适反应温度为35℃,最适反应pH值为5.5,在pH 6～8之间稳定。Zn2+、Cu2+对 Tfchi1活性有明显的抑制作用。抑菌活性测定结果显示,Tfchi1可明显抑制敏感植物病原真菌的菌丝生长和分生孢子萌发。该酶在几丁质资源的开发利用和生物防治等领域具有较广的应用前景。     

稻瘟病菌一假定几丁质酶多克隆抗体的制备及其检测

 为检测几丁质酶的表达,制备稻瘟病菌的一假定几丁质酶多克隆抗体,探索其可能运用。将稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) 几丁质酶基因克隆入融合表达载体pET\|32a,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行诱导表达。表达菌株经0.5 mmol/L IPTG诱导4～6 h后,用Ni²⁺\|NTA亲和柱纯化蛋白,得到可溶的几丁质酶\|His融合蛋白。以该融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体。ELISA分析表明该抗体效价达1∶204 800,特异性良好。用该抗体ELISA检测了稻瘟病菌4个不同田间菌株中,不同的菌株表达量不同。对稻瘟病菌侵染水稻3、5和7d后的病叶进行抗原Western验证,结果表明,稻瘟病菌不同的侵染时间其几丁质酶表达量有明显差异。 几丁质酶表达的差异是否与菌株间致病型等生物学和生理学差异有关,目前正在进一步研究。     

苜蓿实夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因cDNA序列的克隆与序列分析

几丁质脱乙酰基酶(CDA)在昆虫几丁质代谢中具有重要作用.本研究以苜蓿实夜蛾5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到该虫CDA基因的cDNA序列.该序列含有1 984个碱基,包括1个1 626个碱基的开放阅读框,编码一个含541个氨基酸的蛋白,分子量约为61.86 ku.克隆基因推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的3个功能区,分别是几丁质结合区(47～103),催化区(199～355),低密度脂蛋白受体区(124～158).序列比对表明,克隆的苜蓿实夜蛾CDA与其他昆虫的CDA在核苷酸和氨基酸水平上的一致性存在较大差异.苜蓿实夜蛾CDA的氨基酸序列与棉铃虫CDA(GQ411189)一致性达到98%,而与另外3种昆虫粉纹夜蛾CDA(AY966402)、蓓带夜蛾CDA(EU660852)和棉铃虫CDA(GQ411190\GQ411191\EF600051)氨基酸序列间的一致性只有36%～38%,属于两类CDA类群中的一类.基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU1188855.     

几丁质酶基因和β-1.3-葡聚糖酶基因的克隆及双价基因在枯草芽胞杆菌B-908中的表达

 本文综述了几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的研究历史及特点,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的分子生物学方面研究进展,以及几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因在植病生防方面的应用概况。以几丁质酶产生菌粘质沙雷氏菌Serratia marcescens和β-1,3-葡聚糖酶产生菌环状芽孢杆菌Bacillus circulans为供体菌株,提取其染色体DNA。经Sau3 Al部分酶切后,插入克隆质粒pUC19,分别建立了几丁质酶基因文库和β-1,3-葡聚糖酶基因文库。     

枯草芽孢杆菌XF-1中脱乙酰几丁质酶在大肠杆菌中的表达及其抑茵活性

根据脱乙酰几丁质酶同源基因序列设计引物,扩增、克隆和测序了枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌株XF-1的脱乙酰几丁质酶基因（CSrlo该基因编码区为834bp,编码由277个氨基酸组成的约30kD的蛋白质,其基因序列与枯草芽孢杆菌菌株B168的脱乙酰几丁质酶基因的相似性达到99％,氨基酸序列相似性为98％,在第19、47、60、256和257位的氨基酸发生了变化,分别由异亮氨酸代替了菌株B168脱乙酰几丁质酶中的甲硫氨酸、缬氨酸代替了谷氨酸、苏氨酸代替了异亮氨酸、天冬氨酸代替了谷氨酸、赖氨酸代替了天冬酰胺。菌株xF一1对稻瘟病菌Magnaportheoryzae和芸薹根肿菌Plasmodiophorabrassicae有抑制作用,而菌株B168没有。菌株xF－1和B168的CSFI基因在大肠杆菌Escherichiacoli中的表达产物均具有脱乙酰几丁质酶活性,但前者的表达产物对稻瘟病菌及芸薹根肿菌具有抑制作用,而后者没有。表明脱乙酰几丁质酶是xF－1抑制根肿病作用机制之一,且上述5个氨基酸替代可能与抑菌机制有关。     

不同来源的洋葱伯克氏菌基因型对洋葱的致病性分析

通过对农田环境和医院的洋葱伯克氏菌基因型在洋葱上的致病性研究,结果表明,来源于根围的基因型Ⅲ和基因型Ⅰ的部分菌株,以及来源于医院的基因型Ⅰ和Ⅲ菌株均能使洋葱鳞茎腐烂,表现出与洋葱致病菌LMG1222相似的致病症状,但基因型Ⅴ和Ⅸ没有使洋葱发病。农田和医院环境中均存在对洋葱致病的洋葱伯克氏菌,而且各基因型对洋葱的致病性有差异。     

球孢白僵菌SJ-05几丁质酶基因的克隆与序列分析

几丁质酶在昆虫真菌侵染寄主过程中起着重要的作用。本文对采自内蒙古准格尔旗沙棘木蠹蛾的球孢白僵菌菌株SJ-05进行了几丁质酶的基因分析,从中克隆了几丁质酶Bbchit基因,得到了重组质粒pMD19-T/chit。测序结果表明,Bbchit基因核苷酸序列阅读框架全长为1047 bp,编码348个氨基酸,推测分子量为36.924 ku,等电点为5.94。氨基酸序列比对结果表明,与球孢白僵菌Bb0062菌株（AAN41259.1）的氨基酸序列相似性最高,为99.71%。     

越南伯克霍尔德氏菌B418杀线虫活性产物的分离鉴定

为探寻越南伯克霍尔德氏菌B418代谢产物中的杀线虫活性物质,采用色谱分离技术和活性跟踪的方法,从越南伯克霍尔德氏菌B418代谢产物中分离鉴定出六氢-3-(异丙基)-吡咯并[1, 2-a]吡嗪-1, 4-二酮和六氢-3-(苯甲基)-吡咯并［1, 2-a］吡嗪-1, 4-二酮两种活性化合物。生物测定结果显示,两化合物在相对含量比为2. 81∶1,使用浓度为20 mg/mL情况下,对南方根结线虫和秀丽隐杆线虫48 h校正致死率分别为60.45%和67.37%,即对南方根结线虫和秀丽隐杆线虫均有杀虫活性。     

黏虫几丁质酶MsCHT7基因的克隆、表达及蜕皮激素的调控

几丁质酶是几丁质水解的关键酶,在昆虫生长发育中具有重要作用。本试验通过高通量转录组测序获得黏虫几丁质酶基因cDNA序列MsCHT7（GenBank登录号MG551526）。cDNA全长3360 bp,包含一个长度为2970 bp的开放阅读框,编码989个氨基酸,具有1个糖苷水解酶18家族高度保守序列,2个Glyco_18催化结构域和1个几丁质结合结构域ChtBD2。通过基因表达水平研究发现,黏虫MsCHT7基因在不同发育阶段和不同组织中均有表达,且具有差异性。预蛹期和表皮MsCHT7基因表达量最大,蛹期最后1 d和成虫表达量较高,且幼虫各龄期最后1 d表达量均高于第1 d表达量。20E（20-羟基蜕皮酮）处理幼虫后,不同时间点MsCHT7基因表达量存在显著差异,在1～24 h基因表达量随时间逐渐升高,24 h时最高,之后表达量迅速降低。4种不同浓度20E处理后,MsCHT7基因表达量存在一定差异,当浓度为10 μg/μL时,MsCHT7基因表达量最大。通过生物学观察发现,不同浓度20E处理后5龄幼虫蜕皮时间均提前。由于MsCHT7基因表达量受蜕皮激素调控,MsCHT7可能在黏虫蜕皮过程中发挥一定作用。     

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007产嗜铁素的相关基因克隆及条件优化

为了明确吡咯伯克霍尔德氏菌Burkholderia Pyrrocinia JK-SH007是否产嗜铁素,揭示其生防机制,本文通过CAS检测该菌株产嗜铁素的能力,并对其嗜铁素合成相关基因cepR进行克隆及序列分析,同时采用单因素试验及响应面法对菌株JK-SH007产嗜铁素条件进行优化。结果表明,菌株JK-SH007具有明显的产嗜铁素能力,其嗜铁素合成相关基因cepR大小为720 bp,与B.pyrrocinia（EU034001）的亲缘关系最近,同源性为99%,两者序列相似性为97%,13个位点出现SNP;另外菌株JK-SH007 cepR基因编码的氨基酸序列有3个氨基酸发生了替换,两者一致性为97%。该菌产嗜铁素最优培养时间是15 h、pH 8、转速200 r/min、最佳碳源和氮源分别是甘油和氯化铵;PB试验筛选出影响该菌株产嗜铁素的关键性因素分别是pH、加碳量、加氮量;CCD试验结果显示,pH和加氮量的交互作用较明显;最终采用Design-Expert软件分析出菌株JK-SH007产嗜铁素最佳方案为碳源加入量15.00 g/L、氮源加入量10.50 g/L、温度30℃、pH 7.36,优化后菌株产嗜铁素能力由18.59提升到37.86,响应面优化产嗜铁素条件的效果是显著的,嗜铁素产量得到明显提高。     

Cloning, Sequencing and Expression of a Xylanase Gene from the Maize Pathogen Helminthosporium Turcicum

A gene encoding an endoxylanase from the phytopathogenic fungus Helminthosporium turcicum Pass. was cloned and sequenced. The entire nucleotide sequence of a 1991 bp genomic fragment containing an endoxylanase gene was determined. The xylanase gene of 795 bp, interrupted by two introns of 52 and 62 bp, encoded a protein of 227 amino acids showing up to 95% amino acid homology with other fungal xylanases. The precise splicing site of the introns was identified by sequencing the corresponding cDNA. A northern blot showed that the gene is expressed when the fungus is grown in a medium containing xylan as a sole carbon source. The cloned xylanase gene was expressed in maize plants during infection.     

链霉菌769胆固醇氧化酶基因克隆、表达及生物学活性分析

胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,EC 1.1.3.6)是胆固醇降解代谢过程中的关键酶,在食品开发、医疗保健、临床检测、生物农药等方面具有广泛的应用价值。通过PCR方法从链霉菌Streptomyces ahygroscopicus 769的基因组中扩增得到769_ChOA基因(GenBank accession No. KF290994)。该基因全长为1578 bp,编码一个由525 aa组成的蛋白质,蛋白理论分子量为57 kDa,等电点为6.29。769_ChOA与来源于S. natalensis的胆固醇氧化酶基因的同源性为91%。构建了硫氧还蛋白－769_ChOA融合的表达载体pET32a::769_ChOA,以Escherichia coli Origami B(DE3)为表达宿主,获得了能可溶性表达的胆固醇氧化酶重组菌。经Ni亲和层析纯化得到的酶蛋白比活力为5.90 U/mg。酶学性质分析表明,该酶对胆固醇的催化活性最高,对测定的7种胆固醇类似物也都具有一定的催化能力。酶的最适温度和pH范围为20～40 ℃和pH 6.0～8.5,其活性均高于80%,且在30 ℃和pH 7.0时表现出最大的活性,酶活分别达到6.83和6.44 U/mg。酶在低于40 ℃和弱碱性条件下具有很好的稳定性。该酶对鳞翅目害虫亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)和水稻二化螟Chilo suppressalis(Walker)幼虫具有很强的杀虫活性,半致死浓度分别为27.4和17.1 mg/mL。     

绿色木霉几丁质酶基因Tvchi cDNA的克隆、原核表达与活性分析

 利用RT PCR方法从绿木霉ZBS 6中扩增了几丁质酶基因Tvchi,序列分析表明Tvchi 开放阅读框为1 293 bp,编码430个氨基酸残基,Blast 分析表明,与多种木霉18家族内切几丁质酶具有较高的同源性。将该基因克隆到原核表达载体pET 28a上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS PAGE和Western印迹分析表明成功的获得了47 kD 的融合蛋白。该融合蛋白经Ni NTA柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白Tvchi。Tvchi最适酶活温度为37℃,最适酶活pH值为6.8。表达产物对小麦全蚀病、赤霉病、纹枯病病原菌显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为进一步研究木霉几丁质酶的应用提供了基础。     

一个小麦csAtPR5-类似基因的克隆、鉴定和表达分析

 小麦(Triticum aestivumL.)品系‘兰考90(6)’在2AL染色体臂上携带1个隐性抗白粉病基因,暂命名为PmLK906。以‘中国春’/‘兰考90(6)21-12’杂交F₃代纯合株系构建的抗、感cDNA池为探针进行小麦基因芯片杂交,结果表明与粗山羊草(Aegilops tauschii)csAtPR5类似的基因在抗病池中的表达量比感病池中约高2^4.2倍。随后,从‘兰考90(6)21-12’中成功克隆了一个2 125 bp的全长csAtPR5-类似基因cDNA序列,暂命名为TaAetPR5(GenBank登录号:EU082094)。TaAet-PR5与csAtPR5的cDNA序列有93%的相同。TaAetPR5编码1个由657个氨基酸组成的多肽,与csAtPR5有88%的相同。蛋白推导分析表明TaAetPR5的分子量为74.5 kDa,pI 6.82,可能是一个可溶性的球蛋白,存在于细胞核中的可能性是95%。接种小麦白粉病菌(Blumeria graminisf.sp.tritici)后12至72 h,‘兰考90(6)21-12’幼苗叶片中的TaAetPR5基因转录水平不断提高。感白粉病的‘中国春’中没有检测到TaAetPR5基因。     

脐孢木霉菌Trichoderma brevicompactum 0248 tri5基因片段的克隆及表达分析

脐孢木霉菌Trichoderma brevicompactum能合成木霉素等单端孢霉烯类化合物,而基因tri5编码的单端孢霉二烯合酶是合成途径中的关键酶,它催化反式法呢基焦磷酸（tFPP）合成单端孢霉二烯。为分析基因tri5与木霉素合成的关系,本研究从脐孢木霉菌0248中克隆了基因tri5片段,并运用实时荧光定量PCR技术分析了基因tri5在不产木霉素培养基和产木霉素培养基中的差异表达。在相同培养时间下,基因脚在不同产木霉素状态间的表达量差异显著;在培养96h时基因tri5在2种培养基中均达到最大值,基因tri5在产木霉素状态下的表达量是不产木霉素状态下的107．18倍。通过检测产木霉素培养基中基因tr／5表达量与木霉素含量的变化,结果显示木霉素的含量随着基因tr／5表达量的增加而不断增加,在培养96h时达到最大值118．71mg·L-1,推测基因tri5表达量与木霉素合成相关。该研究为基因tri5功能的进一步研究和对脐孢木霉菌0248进行基因工程菌改造奠定了理论基础。