甘肃马鹿肌细胞生成素（MyoG）基因启动子区序列克隆与分析

MyoC基因在肌肉发生过程中具有中心调节作用。根据GeneBank中已发表的猪、人、小鼠和牛的MyoG基因5’侧翼和部分第1外显子序列设计PCR引物,采用Touch—DownPCR技术扩增了甘肃马鹿MyoG基因的启动子区序列,构建了重组克隆载体pMD18-T—MyoG,并通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定、测序及生物信息学分析。结果表明,甘肃马鹿MyoG基因启动子区序列长685bp,其与猪、人和小鼠的同源序列相似性分别为88．1％、84．9％和82．6％,且不同物种间保守性较强。本研究为进一步探讨甘肃马鹿MyoG基因的表达与调控机制奠定了基础。     

野猪肌细胞生成素基因的克隆与序列分析

参考家猪(X89007)MyoG基因序列设计2对特异引物,用PCR方法首次从野猪基因组中扩增出2个大小分别约为1.6 kb和1.0 kb的DNA片段,其PCR产物经pMD-18T载体转化感受态DH5α株大肠杆菌,获得重组克隆子。DNA测序和序列拼接表明:野猪肌细胞生成素基因DNA序列长2 466bp,含完整的3个外显子和2个内含子,与家猪、牛、马、狗、小鼠和人的MyoG基因的cDNA序列同源性分别为99.8%、92.4%、92.7%、89.7%、90.8%和94%,其cDNA编码氨基酸序列与家猪、牛、马、狗、小鼠和人的同源性分别为100%、96.4%、95.9%、94.1%、96.4%、96.8%;对野猪MyoG基因组序列与9个家猪品种的相应同源序列进行比较,检出16个核苷酸变异位点,且其中有5个为家猪中不具有的新变异位点,其变异位点主要发生在内含子部分,尤其是内含子1中的变异位点比例最大(11个)。这些结果表明,野猪肌细胞生成素基因的编码序列在进化过程中是高度保守的,而内含子部分尤其是第1内含子具有丰富的序列多态性。对117个限制性酶切位点扫描分析发现,野猪MyoG基因核苷酸序列中含有78个酶切位点,其中有5个酶切位点包含变异位点,尤其是1 153位点的T突变成G所产生的SmaI(CCC/GGG)或XmaI(C/CCGGG)酶切位点为野猪所特有。所测DNA序列已提交到GenBank中,获得的序列号为:FJ356697。     

内蒙古绒山羊孤核受体RORα部分cDNA克隆及序列分析

依据巳发表的牛、狗、人、小鼠等哺乳动物孤核受体RORα基因序列设计跨内含子引物,以内蒙古绒山羊cD-NA为模板进行RT-PCR扩增,得到417bp的基因序列,将扩增产物进行克隆测序后与GeneBank数据库进行序列同源性比较分析:绒山羊RORαcDNA扩增序列与牛、狗、猪和小鼠的同源性分别为98.3%、95.4%、95.2%和87.8%;与牛、猪、人、马、鼠相比RORα基因氨基酸序列同源性非常高,说明所获得序列为内蒙古绒山羊RORαcDNA序列,而且各种哺乳动物的RORα基因保守性较强.     

猪HK2基因的克隆及序列分析

为克隆猪己糖激酶2基因,分析其生物功能,采用已报道的人及小鼠HK2的cDNA序列为依据,利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物,扩增新的猪HK2基因cDNA序列。将PCR产物克隆测序,分析获得的核苷酸序列及其编码蛋白的特性,分离的开放阅读框全长2754bp,编码917个氨基酸,与人和小鼠的核苷酸序列同源率分别为90%和87%,与人和小鼠的氨基酸序列同源率分别为96%和94%,利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其蛋白结构,为进一步开展猪HK2基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

绵羊Oct4基因启动子序列的克隆及其与猪和牛序列的比较分析

为探明绵羊Oct4基因启动子的结构特点,用PCR方法克隆获得了绵羊Oct4基因启动子,并对绵羊、牛和猪Oct4基因的上游调控序列进行对比分析。结果显示,成功扩增获得长度为2 951 bp的绵羊Oct4基因启动子;绵羊、牛和猪Oct4基因的上游调控序列均含有4个保守区域(CR1–CR4),且4个保守区域在3个物种间具有高度同源性;CR1区域富含GC碱基对,且序列上的Sp1/Sp3位点与激素反应元件HRE在3个物种中具有100%的同源性;绵羊和牛、猪的上游调控序列富含GC,并存在大量的CCC(A/T)CCC位点。     

小鼠ISG15基因5′调控区序列的克隆及序列分析

采用LA-PCR技术扩增小鼠ISG15基因1194bp的5′调控区序列,构建了重组克隆载体pEGFP-N1-ISG15,对阳性克隆进行了PCR扩增、限制性酶切鉴定、DNA测序及生物信息学分析。结果表明:试验成功构建了包含小鼠ISG15基因5′调控区的重组质粒;经同源性比对发现ISG15基因5′调控区在不同物种中同源性不高,在转录起始位点近端的启动子区域中小鼠与人、牛、乌鳢的同源性分别为41.36%,37.89%,38.71%;经过预测该调控区富含GAS、GR、SP1、NF-1、CBF-B等转录因子结合位点,有五处Enhancer区、一处ISRE元件以及一处保守的NF-κB结合位点。本研究为进一步确定小鼠ISG15基因核心启动子区域及该基因的表达调控奠定了理论基础。     

猪Reg4剪切体Reg4v1和Reg4v2的cDNA克隆和组织分布

从猪肠道组织中提取总RNA,通过RT-PCR对Reg4基因进行cDNA扩增,获得了726 bp和832 bp的两个片段。将PCR产物分别与pMD-19T载体连接后转化E.coliJM109,检测阳性克隆、测序并进行序列分析。同源分析结果表明,克隆的猪Reg4 Variant2基因与人、小鼠、牛的同源性分别为71.6%、63.3%、73.6%;组织分布结果显示:猪Reg4 Variant1和Reg4 Variant2基因在肠道组织各部分均有分布。克隆的猪Reg4 Variant1和Reg4 Variant2基因分别注册GenBank(Accession.FJ469910,FJ469911)。     

猪脂肪特异性蛋白27基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,克隆并分析了猪脂肪特异性蛋白27基因.各种组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coli JM109,检测阳性克隆并测序.猪FSP27基因的cDNA序列,其全长为745bp,开放阅读框为11-72Top,编码有238个氨基酸.同源分析结果表明,猪FSP27的核酸序列与人、小鼠和牛的同源性分别为86%、77.6%、82.3%.氨基酸序列的同源性分别为83.2%、74.4%、79.3%.组织分布结果显示:猪FSP27基因在多种组织均有分布.克隆的猪FSP27基因并注册GenBank(Accession.EU395789).     

猪干扰素IFNE1基因克隆及重组表达载体的构建

依据电子延伸序列设计一对克隆引物,用RT-PCR法从猪胃组织扩增出猪干扰素epsilon1(IFNE1)基因的完整编码区并进行序列分析;再根据克隆的序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出EcoRI/XhoI酶切位点的猪IFNE1片段,插入原核表达栽体,转化至宿主菌,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白.结果表明,克隆的猪IFNE1基因包含完整的开放阅读框架,长为586bp.ORF为582bp,编码193个氨基酸,与人、小鼠的同源性分别为83.6%和69.2%,推测的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为76.2%和55.2%,表达的融合蛋白分子量约为47kD.     

胡萝卜sⅡ基因启动子克隆及序列分析

克隆胡萝卜直根特异性表达的液泡转化酶Ⅱ型同工酶(sⅡ)基因启动子序列,为实现外源基因在胡萝卜直根特异性表达做准备。从天红五寸参胡萝卜叶片中提取总DNA,采用PCR扩增方法获得sⅡ基因启动子序列,然后结合5'RACE实验方法和生物信息预测方法对sⅡ基因启动子进行序列特征分析。结果表明:从胡萝卜基因组DNA中PCR扩增得到预期大小的启动子片段,序列分析表明该启动子序列与已发表的序列具有99.6%的同源性;试验确定了该启动子的转录起始位点位于翻译起始位点上游26bp处的“A”;生物信息学预测该启动子的核心序列及上游增强子序列、抑制子序列、根特异性序列及受病原菌、损伤、干旱、ABA激素调控序列等顺式作用元件。成功克隆并序列分析了胡萝卜直根特异性表达的sⅡ基因启动子,为该启动子在植物基因工程中的应用奠定基础。     

西川红景天nrDNA ITS序列初步研究(英文)

[Objective] The study aimed to analyze the ITS sequences of nrDNA from Rhodiola alisa and investigate the difference of evolution rate between nrDNA and trnS-trnG and rpl20-rps12 sequences of cpDNA(chloroplast DNA).[Method]Total DNA was extracted from silica-dried leaves of R.alsia by using modified CTAB method.With the extracted DNA sample as template,nrDNA ITS region was amplified,then purified and sequenced.In addition,the yielded ITS sequences were also compared with the known trnS-trnG and rpl20-rps12 sequences of cpDNA from R.alsia.[Result]The ITS sequence of nrDNA from R.alsia was 701 bp in length,of which 13 variable sites were found with a percentage of 1.85%.Of the 13 variable sites,8 were caused by point mutations,5 were the results of insertions or deletions.The(A+T)content and(G+C)content were 46.9% and 53.1%,respectively.The nucleotide diversity(π)was 0.004 27.[Conclusion]The ITS region of nrDNA from R.alsia was more conservative and evolved more slowly than the trnS-trnG and rpl20-rps12 sequences of its cpDNA.     

番茄抗花叶病毒基因类似序列扩增研究

[目的]研究番茄抗花叶病毒基因类似序列扩增。[方法]以选育和生产上广泛使用的20个番茄品种为试材,对其进行了田间和实验室抗花叶病毒病（ToMV）筛选、基因类似序列扩增、RAPD聚类分析及特异引物PCR扩增。[结果]美味樱桃番茄、中杂9号、早红宝、W262-4、OH-2-2-11、黄圣果和美国番茄对ToMV具有较强的抗性;根据聚类分析,受试品种可分为3类,从中选出9个抗性和非抗性品种进行抗ToMV基因类似序列分析,其中非抗性和购买无抗性番茄品种未扩增出任何谱带,而抗性品种扩增出约300 bp的谱带,初步认为该谱带为抗ToMV类似序列基因。[结论]为培育抗花叶病毒病的番茄品种提供了理论依据。     

西川红景天nrDNA ITS序列初步研究

[目的]对西川红号天nrDNA ITS序列进行分析,并与cpDNA（叶绿体DNA）trnS-trnG序列和rpl20-rps12序列进行比较,从而初步比较2套植物基因组的进化速率。[方法]采用改良CTAB法从硅胶干燥的西川红景天叶片中提取总DNA,并对nrDNA ITS区进行扩增、纯化、测序,然后与cpDNA trnS-trnG和rp120-rps 12序列进行比较。[结果]序列比对后得到长度为701bp的ITS序列,其中变异位点13处,占总序列的1.85％。在13处变异位点中,8处为碱基置换,5处为插入／缺失。（A＋T）含量为46．9％,（G＋C）含量为53．1％。核苷酸多样性为0．00427。[结论]西川红景天nrDNA ITS区域较cpDNA trnS-trnG序列和rp120-rps12序列保守,进化速率较慢。     

大豆基因组保守序列及综合保守序列扩增多态性分子标记(ICSAP)的设计

采用VBA程序查找了大豆基因组保守序列——在基因组中出现次数较多的碱基序列片段,分析了这类保守序列的基本特性,在此基础上,设计了一种新型分子标记——综合保守序列扩增多态性分子标记.碱基数目越多,保守序列种类数和出现次数越少,从10个碱基到27个碱基,保守序列的GC含量先是逐渐增加,达到一个平台后又逐渐降低.碱基离保守序列3＇端越近,出现A或T的可能性越大,碱基在保守序列中的分布具有非随机性.不同长度的保守序列具有明显的进化关系.筛选出10个碱基的保守序列和长度为8个碱基的填充序列用来设计引物,共得到566对引物组合.该新型分子标记有望在条带多态性、引物一致性等方面超越现有分子标记,同时具有成本低廉等优点.该研究旨在为基因组保守序列查找和分子标记设计方面提供新的思路,分析这些保守序列特性有助于进一步探索分子进化机理.该新型分子标记有可能在大豆种质资源鉴定和基因图位克隆等方面得到应用,同时该分析方法也适用对其他物种.     

6份狼尾草属菌草的ITS和叶绿体matK序列分析

对来自福建农林大学、闽清、闽侯和南平等地的6份狼尾草属菌草的ITS片段和叶绿体matK基因序列进行测定,并用Clustal X 2.0和MEGA 4.1软件对其进行比对分析,构建系统发育树.结果表明,6份菌草的ITS序列长度均为585 bp,其中变异位点0-3个,信息位点2个,遗传距离为0-0.089,平均遗传距离为0.022;mat K序列长度为880-881 bp,其中变异位点(信息位点)1个,遗传距离为0-0.016,平均遗传距离为0.010.ITS系统树结果显示6份共菌草聚成四类,其中杂交狼尾草和象草(MQ)聚类在第I类的同一分支,巨菌草和象草聚在第Ⅱ类的不同分支,表明其亲缘关系比较近;mat K序列系统树结果除了象草(MQ)外其余5份菌草均聚在了同一分支上,表明叶绿体mat K序列无法将供试的6份菌草区分开.     

吉林地区马铁菊头蝠MHCⅡDRB基因第２外显子的克隆及序列分析

为了研究翼手目序列中马铁菊头蝠DRB基因第2外显子的遗传多态现象,试验检测了从一个种群得到的17个蝙蝠个体。结果从17个个体中克隆获得42条不同序列,长度为263 bp(仅4例为260 bp)。经序列分析发现,部分个体存有多种序列、不同个体间存有相同序列,提示马铁菊头蝠MHCⅡ DRB基因第2外显子可能存在着重复座位和基因共享。氨基酸的替换趋于集中在假定的抗原结合位点附近。利用MEGA软件构建的NJ树表明,马铁菊头蝠聚为一支,而与其他动物分离。结果表明:马铁菊头蝠MHCⅡ DRB基因第2外显子有较高的多态性,这与其他哺乳动物很相似。     

草莓镶脉病毒(SVBV) ORF Ⅰ基因的克隆及序列分析

用CTAB法从感染草莓镶脉病毒(SVBV)的草莓叶片中提取总DNA,设计特异性引物扩增含有SVBVORF Ⅰ的片段,克隆并测序.序列分析表明,该片段全长1 033个核苷酸,其中包含的ORFⅠ全长987个核苷酸,编码328个氨基酸.结果表明:将其与花椰菜花叶病毒属其他成员的ORF Ⅰ序列相比较,中国SVBVORFⅠ与美国SVBV ORFⅠ序列相似性最高,达88.3％.进一步构建SVBV及其同属其他成员ORFⅠ的系统关系树,结果显示:中国SVBV ORF Ⅰ与美国SVBV ORFⅠ单独形成1个亚分支,说明来源于草莓的2个SVBV亲缘关系最近.     

天台山4种鹅耳枥属植物ITS序列的克隆与分析

通过克隆和分析雷公鹅耳枥(Carpinus viminea)、短尾鹅耳枥(C. londoniana)、多脉鹅耳枥(C. polyneura)和天台鹅耳枥(C. tientaiensis)的ITS序列,为鹅耳枥属植物的分子鉴定和遗传多样性研究提供依据。利用PCR法从4种鹅耳枥叶片DNA中克隆到各自的ITS,以ClustalX,EXCEL和MEGA等软件分析和比较序列特征,并从NCBI数据库下载另外7种鹅耳枥的ITS序列用于进化分析。序列已上传至NCBI,登录号为JF796531JF796534。结果表明,4种鹅耳枥属植物ITS的全长为600～602 bp,具26个变异位点,部分位点有明显的物种特征,可用作DNA指纹特异性识别。进化分析的结果表明,11种植物的遗传距离为0.0048～0.0681,表现为种间关系。4种采自天台山的鹅耳枥分属3个不同进化枝,多脉鹅耳枥与阿里山鹅耳枥和云南鹅耳枥处于同一分枝,天台鹅耳枥与欧洲鹅耳枥和湖北鹅耳枥归为一类;而短尾鹅耳枥、雷公鹅耳枥则与美洲鹅耳枥聚为一组。     

Loxp序列位置对基因表达的影响

【目的】先选用绿色荧光蛋白基因（egfp）作为试验基因构建loxp位点位于egfp基因上游或下游不同位置的表达结构,对loxp位点的位置对基因表达的影响进行初步分析。然后以植酸酶（phytase）基因为另一个试验基因对通过egfp基因得出的结果进行进一步验证。研究结果为开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2A序列连接共表达的转基因动物制作中,打靶位点的选择提供可靠依据。【方法】先选择增强绿色荧光蛋白基因（egfp）为试验基因,红色荧光蛋白基因（dsred2）为内参基因。以pEGFP-N2、pGEM-5zf-loxp质粒为基础,构建了ploxp-EGFP（loxp序列位于egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区）、pEGFP-loxp（loxp序列位于egfp基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区）、ploxp-EGFP-loxp（egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列）。以pEGFP-N2质粒为对照质粒,以pDsRed2-N1为内参质粒,与所构建的egfp基因各表达质粒共转染PK15细胞,转染24h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况,用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度,进而应用SPSS19.0软件对各转染荧光表达情况进行分析,确定loxp序列的位置对基因表达的影响。为了对以egfp基因为试验基因所得到的结果进行进一步验证,本试验选择植酸酶（phytase基因）基因为试验基因,egfp基因为转染内参基因萤火虫荧光素酶基因（luciferase基因）为表达内参基因。以pIREsNEo、pGEM-5zf-loxp和pT-phytase、pGL4.13[luc2/SV40]质粒为基础。构建了p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase（loxp序列位于phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区）、p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp（phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列）、p-SV40-luciferase-CMV-phytase-loxp（loxp序列位于phytase基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区）和p-SV40-luciferase-CMV-phytase（phytase基因开放阅读框的上下游均无loxp序列）等试验质粒,以egfp基因(pEGFP-N2)为转染内参基因与所构建的各种phytase基因表达结构共转染PK15细胞,同时设置一个转pEGFP-N2+ pDsRed2-N1的空白对照。转染48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白基因表达情况,用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度,应用SPSS19.0软件对各转染绿色荧光表达情况进行分析。同时应用钼蓝法测定各转染的植酸酶活性。应用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒检测各转染萤火虫荧光素酶活性。用SPSS19.0软件对各转染的植酸酶和萤火虫荧光素酶表达水平（活性）进行统计分析。【结果】试验中以dsred2为内参基因,对转染后每个转染的不同区域红色荧光强度平均值(代表各转染红色荧光蛋白的表达水平)进行统计分析表明egfp基因各结构每个转染的间红色荧光蛋白表达水平差异不显著,表明不同转染间排除了转染操作、质粒纯度、细胞活性等的差异对分析结果的影响,转染前质粒的电泳结果表明,各质粒间不同构象的质粒比例基本一致,这也基本排除了转染用质粒质量的差异对转染效果的影响,对各转染不同区域绿色荧光强度的平均值（代表各转染的egfp基因表达水平）进行的统计分析表明,同一结构不同转染间egfp基因表达水平差异不显著,不同结构的转染间存在差异,其中ploxp-EGFP和ploxp-EGFP-loxp结构转染中绿色荧光蛋白的表达水平显著低于pEGFP-loxp和pEGFP-N2,而pEGFP-loxp和pEGFP-N2转染间egfp基因间的表达差异不显著。这一结果初步说明loxp序列在外源基因开放阅读框下游时对基因表达水平没有影响,在外源基因开放阅读框上游时对基因表达呈负影响,为了进一步验证上述结果的可靠性,本研究以植酸酶基因作为另一试验基因,以萤火虫荧光素酶基因为表达内参基因,以egfp基因为转染内参基因再次进行了验证,验证试验得到了相似的结果。【结论】开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2A序列连接,实现外源基因和内源基因共表达的转基因动物制作研究中,以Cre/loxp系统作为报告基因删除工具时,则内源基因的下游为最佳的打靶位点。     

杨树锈菌表达序列微卫星分析及EST-SSR标记开发

通过对64 498条杨树锈菌EST进行拼接,得到1 998个拼接片段(contigs),发现了604个SSR位点。在拼接片段中SSR平均密度为每736.6 bp含有1个SSR。在SSR中,三核苷酸重复基元的SSR类型最多,占总数的44.70%。在二碱基重复中,最主要的优势重复单元是AC和AT,三碱基中AGT和AAG为优势重复单元,四碱基、五碱基重复类型中,(AAAN)n和(AAAAN)n为对应的优势重复单元,这些优势重复单元中富含碱基A和T,研究还发现杨树锈菌表达序列中微卫星丰度很高。杨树锈菌突变频率很高,由试验结果推测杨树锈菌基因中含有的微卫星序列是杨树锈菌基因变异的一个重要驱动力。杨树锈菌EST序列中高度变异的微卫星(长度大于20 bp)约占15.07%。针对检测到的微卫星位点,共设计了455对引物,并选取了30个SSR引物对对杨树锈菌基因组DNA进行PCR扩增,其中有27个引物对扩增成功,占90.0%。扩增产物电泳结果显示,有21个引物对扩增出的谱带在预期片段大小范围之内,有8个引物对在杨树锈菌DNA中检测到了多态性,多态性引物对占26.7%。