利用Cre/lox定位重组系统获得无选择标记GFP转基因烟草

【目的】利用Cre/lox系统具有的特异重组特性,以绿色荧光蛋白GFP为目的基因,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【方法】将Bar基因表达盒置于两个同向lox位点之间并与GFP基因表达盒融合后获得相应植物表达载体,转化烟草后获得抗除草剂Basta的GFP转基因植株。GFP转基因植株叶盘二次转化导入重组酶Cre基因后,实现与GFP基因连锁的Bar基因表达盒剔除,剔除Bar基因的植株开花后自交使重组酶Cre基因分离,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【结果】将含Bar基因表达盒以及GFP基因表达盒的植物表达载体转化烟草Wisconsin 38后获得了抗除草剂Basta以及GFP荧光表达的转基因植株。随机抽取5株转基因植株二次转化导入Cre基因,所获得的再生植株叶盘进行Basta的抗性检测,绝大多数单株对应叶盘在含8 mg•L-1 PPT（phosphinothricin）的筛选培养基上无法再生死亡,删除效率在76%～100%。对Bar基因删除后区域片段进行克隆测序分析显示,Bar基因表达盒已经被精确删除。Bar基因删除植株开花后自交,获得的自交后代进行NPTⅡ抗性检测,NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有GFP基因。【结论】利用Cre/lox系统获得烟草无选择标记的转基因植物是稳定可行的,可广泛应用于其它无选择标记转基因植物的培育。     

甘蓝转TA29—Barnase基因植株的花器特征及育性分离的初步研究

利用分子生物学方法，将控制作物育性的基因（TA29-Bamase）转化甘蓝生物体，培育出了甘蓝雄性不育植株。带有TA29-Barnase基因的雄性不育植株的园艺学性状与未转化植株相同，并且其性状在后代中稳定不变；不育植株的花朵表现雄蕊完全退化，但蜜腺和雌蕊健全，能接受外来花粉，杂交结实率较高，同时，雄性不育植株的不育性在后代中出现分离，不育株率占12.5%～85.7%；此外，不育性状具有镶嵌性。     

基于AlcR/alcA和Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系

 【目的】通过构建能够在植物生长发育阶段经乙醇诱导将选择标记基因删除的载体,消除选择标记基因带来的潜在安全隐患。【方法】利用AlcR/alcA诱导系统和Cre/loxP位点特异性重组系统删除选择标记基因。当外源诱导物乙醇存在时,激活下游Cre的表达。Cre重组酶识别2个同向loxP位点,剔除位点之间的DNA片段,包括选择标记基因、AlcR/alcA系统和Cre/loxP系统,而目的基因gus在诱导前后均为组成型表达。【结果】拟南芥转基因植株受乙醇诱导严格控制Cre表达的“开”和“关”。经诱导的转基因植株不能在选择培养基上继续生长。分子生物学检测显示,2个同向loxP位点间序列均已删除,表明标记基因删除效果明显。【结论】基于AlcR/alcA和Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系切实可行,有广泛的应用前景。     

人工雄性不育基因及恢复基因表达载体的构建

结合Cre/loxp定位重组系统和杂种一代的育种特点,构建了雄性不育基因表达载体pCABARTABn和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre.将位于质粒pTIABn中的雄性不育基因表达盒(含TA 29启动子、barnase基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp 2个同向lox位点之间,再将上述表达盒连同lox位点切下插入pCAMBar,获得以除草剂Basta为筛选剂的雄性不育基因表达载体pCABARTABn.PCR方法从溶原菌BM 25.8基因组DNA扩增出Cre基因,克隆测序验证无误后插入PBI 525 CaMV 35 S-35 S双启动子和Nos终止子之间,再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点,得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre.     

大豆细胞质雄性不育恢复基因的标记定位

利用三系法生产大豆杂交种能够有效提高大豆产量。为挖掘大豆三系育性恢复基因,利用大豆细胞质雄性不育系SXCMS1A与恢复系AHH-8构建F2育性分离群体,开展不育系育性遗传分析及育性恢复基因初定位研究。结果表明,F1群体花粉镜检为半不育,成熟期植株结实正常;F2群体花粉镜检可育株与半不育株的分离比为1∶1,成熟期植株结实正常无不育株,从而推测该大豆细胞质雄性不育系为单基因配子体不育。利用SSR标记对F2群体进行分析,获得了位于D1a连锁群上的2个与恢复基因紧密连锁的标记Satt184和Satt267,遗传距离分别为17.3,10.2 c M。因此,将恢复基因定位于D1a连锁群上,可为下一步精确定位恢复基因奠定基础。     

人工雄性不育基因及恢复基因表达载体的构建

结合Cre／loxp定位重组系统和杂种一代的育种特点,构建了雄性不育基因表达载体pCABARTABn和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre。将位于质粒pTTABn中的雄性不育基因表达盒(含TA29启动子、barnase基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp2个同向lox位点之间,再将上述表达盒连同lox位．占、切下插入pCAMBar,获得以除草剂Basta为筛选剂的雄性不育基因表达载体pCABARTABn。PCR方法从溶原菌BM25．8基因组DNA扩增出Cre基因,克隆测序验证无误后插入PBI 525 CaMV 35 S-35S双启动子和Nos终止子之间,再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点,得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre。     

矮牵牛雄性不育性状的遗传分析初探

【目的】初步探索矮牵牛雄性不育性状的遗传规律,选育雄性不育两用系。【方法】从矮牵牛328自然群体后代中发现并选择不育株,以不育株(08A328)为母本,以7份不同来源的材料为父本进行杂交,杂交后代(F1)自交获得F2,选择F2分离出的不育株与F1回交,同时对F2不育株进行人工自交结实率试验和花粉生活力测定。在F2中优选不育株与经济性状优良的父本进行回交转育,转育后代自交,子代兄妹交,筛选可育株与不育株数量按1∶1分离的株系。【结果】F1后代全可育,F2后代可育株与不育株数量按15∶1分离,回交后代可育株与不育株数量按3∶1分离。不育株花药干瘪微黄,花粉无活力,自交不结实。回交转育后代均可育,自交后可育株与不育株数量按15∶1分离。经兄妹交筛选,初步育成矮牵牛雄性不育"两用系",其基因型为ms1ms1ms2ms2、MS1ms1ms2ms2或ms1ms1MS2ms2。【结论】该矮牵牛雄性不育性由2对隐性等位核基因控制,不育株率稳定在50%,不育度高。     

大豆M型质核互作雄性不育恢复基因的遗传研究

用M型质核互作雄性不育系W931A(A)、同型保持系W931B(B)及3个地理来源不同的恢复系WR99032(R1)、WR0088(R2)、WR0108(R3)及其测交后代群体F1(A×B)、F2、BC1a(A×F1)、BC1b(F1×B)、F1a[A×(恢复系×恢复系)F1]、F1b[(恢复系×恢复系)F1×B]作为试验材料,以花粉育性和植株育性指标对不育系的育性恢复特性进行了初步分析.结果表明:大豆M型质核互作雄性不育系属配子体不育,3个不同来源恢复系的育性恢复受一对显性主效恢复基因控制,可能还存在微效修饰基因;3个恢复系的细胞质均为可育细胞质;恢复系R1与R2、R3的恢复基因呈非等位性,恢复系R2与R3的恢复基因呈等位性.     

Cre／loxp重组系统在转基因植物中删除标记基因的应用

在植物遗传转化中,标记基因是必须的,但标记基因的存在引起人们对转基因食品安全性的关注。Cre／loxp重组系统可用于删除转基因植物中的标记基因,可以通过杂交或二次转化,或瞬时表达、诱导表达、组织特异表达重组酶来获得无标记基因的转基因植株。     

油菜雄性不育基因工程植株的建立及鉴定

用含有抗除草剂溴苯腈与雄性不育嵌合基因、抗除草剂溴苯腈与育性恢复嵌合基因转化油菜下胚轴组织，分化再生获得转基因雄性不育植株和育性恢复植株。用除草剂溴苯腈对转基因雄性不育植株和育性恢复植株进行抗性鉴定，抗性可达１０－３ｍｏｌ／Ｌ。再以抗溴苯腈基因为探针分别对其进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，杂交结果均为阳性。对两种植株花器解剖表明，雄性不育植株的花丝明显比花柱短，花粉少，育性恢复植株与正常植株相同     

Construction of Marker-Free GFP Transgenic Tobacco by Cre/Iox Site-Specific Recombination System

Marker-free GFP transgenic tobacco plants were constructed based on Cre/lox site-specific recombination system. A GFP gene was introduced into the tobacco genome using the Bar gene as a linked selectable marker flanked by recombination sites in a directed orientation. The Bar gene expression box was subsequently excised from the plant genome by a strategy of Cre gene retransformation. After removal of the Cre-NPT Ⅱ locus by genetic segregation through self-cross, plants that incorporated only the GFP transgene were obtained. Transgenic tobacco plants mediated by Agrobacterium tumefaciens were obtained, which resisted herbicide Basta and GFP expressed well, then the Cre gene was subsequently introduced into 5 plants of them, respectively, by retransformation. The leaf disks from Cre transgenic plants were used to test the resistance to Basta on the medium with 8 mg L-1 of PPT. The results showed that few discs were able to regenerate normally, and the excision at 76-100% efficiency depended on individual retransformation events. Evidence for a precise recombination event was confirmed by cloning the nucleotides sequence surrounding the lox sites of the Basta sensitive plants. The result indicated that the excision event in the recombination sites was precise and conservative, without loss or alteration of any submarginal nucleotides of the recombination sites. Bar gene excised plants were selfpollinated to allow segregation of the GFP gene from the Cre-NPT Ⅱ locus. The progenies from self-pollinated plants were scored for Kan senstivity, then the segregation of GFP gene from Cre-NPT Ⅱ locus in the Kan senstive plants were confirmed by PCR analysis subsequently. Hence, constructing marker-free transgenic tobacco plants by Cre/lox sitespecific recombination system was reliable, and the strategy presented here should be applicable to other plants for the construction of marker-free transgenic plants as well.     

粳稻转基因恢复系的研究

利用基因枪转化法将抗除草剂的bar基因和抗二化螟的SCK(修饰后的CpTI)基因导入到优质粳稻恢复系超优一号中。经对转基因植株进行分子检测,表明外源基因已整合到水稻基因组中;经田间除草剂抗性检测和二化螟接种鉴定,表明转基因稳定株系直到T6仍表现高抗除草剂且没有分离,说明bar基因能稳定遗传并高效表达;转基因恢复系与非转基因恢复系相比,抗虫性有所提高,但提高程度在株系间有差异。经对转基因恢复系所配杂交组合进行除草剂检测和优势测定,表明转基因杂交稻也高抗除草剂,且F1全部正常结实,结实率达80%以上,并具很强的杂种优势,说明亲本抗性基因通过制种已转移到F1中并得到高效表达,同时说明外源基因的导入没有改变原受体的优良性状;经对部分转基因杂交稻进行纯度鉴定,表明秧田喷施除草剂后,本田的不育株率和杂株率明显降低,特别是两系杂交稻效果更明显。     

粳稻转基因恢复系的研究*

 利用基因枪转化法将抗除草剂的bar基因和抗二化螟的SCK（修饰后的CpTI）基因导入到优质粳稻恢复系超优一号中。经对转基因植株进行分子检测，表明外源基因已整合到水稻基因组中；经田间除草剂抗性检测和二化螟接种鉴定，表明转基因稳定株系直到T6仍表现高抗除草剂且没有分离，说明bar基因能稳定遗传并高效表达；转基因恢复系与非转基因恢复系相比，抗虫性有所提高，但提高程度在株系间有差异。经对转基因恢复系所配杂交组合进行除草剂检测和优势测定，表明转基因杂交稻也高抗除草剂，且F₁全部正常结实，结实率达80%以上，并具很强的杂种优势，说明亲本抗性基因通过制种已转移到F₁中并得到高效表达，同时说明外源基因的导入没有改变原受体的优良性状；经对部分转基因杂交稻进行纯度鉴定，表明秧田喷施除草剂后，本田的不育株率和杂株率明显降低，特别是两系杂交稻效果更明显。     

甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复材料的创制

【目的】探讨外源萝卜恢复基因的导入途径与筛选方法,转育甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育（Ogu CMS）恢复材料,为甘蓝型油菜Ogu CMS育种应用创造条件。【方法】以萝-蓝（Raphanobrassica,2n=58）为供体材料,利用嫁接克服远缘杂交生殖障碍导入外源恢复基因,对获得的属间杂种依次进行甘蓝型油菜性状、自（异）交结实性状以及恢复率稳定性状等特征特性强化筛选。【结果】育成一份甘蓝型油菜Ogu CMS纯合恢复材料CLR650,体细胞染色体数目为38-40条,减数分裂过程中部分细胞存在染色体落后及形成染色体桥等异常现象,但细胞异常对花粉正常形成没有明显影响,恢复株自交、测交均为100%可育。以基于Ogu CMS恢复基因（Rf0）设计的特异分子标记进行检测,证明该材料存在Ogu CMS恢复基因。以与之连锁其它萝卜分子标记分析比较,表明其萝卜片段长度短于国外同类恢复系R113。【结论】CLR650的育成为甘蓝型油菜Ogu CMS创制了新型恢复材料。     

大白菜雄性核不育基因的染色体定位及AFLP分子标记筛选

 【目的】基因定位是遗传研究的重点内容,也是育种工作的重要基础。本研究以大白菜雄性不育两用系‘大阳AB系’和大白菜系列初级三体为材料,对决定大白菜雄性不育性的核基因（ms）进行染色体定位和分子标记筛选,旨在为其分子克隆和遗传利用奠定基础。【方法】基因的染色体定位采用初级三体遗传分析和χ2测验法,分子标记采用AFLP分析方法。【结果】大白菜‘大阳AB系’的雄性不育系（msms）×大白菜系列初级三体（Tri-1、Tri-2、Tri-3、Tri-4、Tri-5、Tri-6、Tri-7、Tri-8、Tri-9）的9个杂交组合中,F1均为可育株;从F1选出三体植株进行自交和测交,其自交子代（F2）和测交子代（Tc）中可育株与不育株的分离比例,只有Tri-4表现为15.5﹕1（F2）和3.24﹕1（Tc）、不符合孟德尔的单基因遗传分离比例（3﹕1和1﹕1）,其它三体在2.60﹕1～3.76﹕1（F2）和0.81﹕1～1.48﹕1（Tc）、均符合孟德尔的单基因遗传分离比例（3﹕1和1﹕1）,这表明该雄性不育性的遗传与Tri-4的遗传表现一致,即确定该雄性不育性的基因位于大白菜4号染色体上。基于染色体和染色单体分离的三体遗传分析表明,该雄性不育基因位于4号染色体的近着丝点区域,通过对124个AFLP引物组合的筛选,初步获得了一个与雄性核不育基因位点连锁的AFLP标记E34M49(398 bp),遗传距离约为1.2 cM。【结论】利用初级三体遗传分析首次将大白菜雄性核不育基因定位在第4号染色体上。     

水稻不育系槟榔红A的选育

【目的】为了增加特种稻种质资源,解决白米不育系配组红香米杂交稻F1易混杂白米,影响米质的问题。【方法】采用常规育种方法,将低直链淀粉含量的亲本材料与带香味的亲本材料进行杂交、回交、转育等。【结果】育成直链淀粉含量为11.07%、香味明显、食用口感佳的水稻三系不育系槟榔红A,为红香米三系杂交稻的配组应用提供了新的种质资源。     

新杂棉2号胞质不育系母本1038A的选育

[目的]培育新的哈克尼西胞质不育系,实现棉花三系配套。[方法]采用回交转育的方法,进行棉花胞质雄性不育系的培育。[结果]利用农一师哈克尼西胞质不育系作为母本,农七师稳定的高代优质棉品系1038作保持系,进行连续6年12代的转育,选育成新的高品质胞质不育系1038A。不育系1038A具备胞质不育系的特点:100%的不育,与哈克尼西胞质不育系相比,具有大铃、优质、抗病的特点。利用海岛棉恢复系97!1R和1304R均可使其F1代恢复育性。[结论]用不育系1038A与海岛棉恢复系1304R配置的杂交组合科杂7号表现为大铃、高衣分、早熟、丰产、优质、抗病的特点,2006年被新疆自治区品种委员会审定并命名为新杂棉2号。     

越冬枝条嫁接对红麻雄性不育系与保持系

【目的】为建立红麻雄性不育系、保持系与杂交种子生产技术体系提供理论依据。【方法】以南宁单瓣木芙蓉和红麻野生种H040的越冬枝条为砧木,以红麻细胞质雄性不育系763A和保持系763B越冬枝条上的新生芽为接穗,采用单芽切接法嫁接后扦插繁殖,成活后移栽大田与本砧嫁接株和种子繁殖株进行对比试验。【结果】不育系嫁接处理的成活率显著高于保持系嫁接处理,用红麻野生种H040作砧木表现出较高的嫁接成活率,而用木芙蓉作砧木的成活率较低;嫁接处理可使植株矮化,其中以木芙蓉作砧木的矮化效果最显著;嫁接对红麻的现蕾开花始期影响不大;用H040和木芙蓉作砧木的处理,其接穗的梢部枯萎长度显著小于本砧嫁接,表现出较强的越冬抗寒性;结果数的多少与越冬期的梢部枯萎长度呈极显著负相关,结实越多,越冬抗寒性越差。【结论】越冬枝条嫁接对红麻不育系与保持系成活率及越冬抗寒性存在一定差异;嫁接处理可使植株矮化;选择适当的砧木对提高接穗的抗寒性有积极作用。