香榧ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选

以香榧Torreya grandis ‘Merrillii’基因组DNA为材料,对影响简单序列重复区间扩增?鄄聚合酶链式反应（ISSR-PCR）的Taq酶用量、Mg²⁺浓度、模板DNA用量、磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度和引物浓度等进行了优化试验。优化后的香榧ISSR-PCR扩增体系为：总容积20 μL,包括30 ng模板DNA,16.67 nkat Taq酶,0.350 μmol·L -1引物,1.625 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.250 mmol·L^-1 dNTPs,10 × PCR buffer 2 μL。PCR扩增程序：94 ℃变性5.0 min;35个循环：94 ℃变性30 s,退火45 s,退火温度视引物而定,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7.0 min,4 ℃保温。在此基础上,从77个ISSR引物中筛选出34个适合香榧ISSR分析的引物,且通过梯度PCR确定了各自最适的退火温度。研究结果为香榧遗传图谱构建打下了基础。图4表1参12     

山核桃SRAP体系的建立及与RAPD和ISSR标记的比较

以山核桃Carya cathayensis基因组DNA为模板,对聚合酶链式反应（PCR）体系各组分进行了梯度实验,优化出条带清晰、重复性好的相关序列扩增多态性聚合酶链式反应（SRAP-PCR）扩增体系,并筛选了引物。该体系（25.00 μL）为：1 × 缓冲液0.20 mmol·L^－1,脱氧核糖核苷酸（dNTPs）,0.20 μmol·L^－1 引物,2.00 mmol·L^－1镁离子（Mg²⁺）,33.34 nkat Taq DNA 聚合酶,0.80 mg·L^－1基因组DNA（以上均为终浓度）。反应条件为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,35 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,5个循环;94 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30个循环;72 ℃延伸8 min,4 ℃保存,反应时间比其他体系缩短了一半。从100对引物中筛选出了适用于山核桃的引物15对。在山核桃中,随机扩增多态性DNA（RAPD）,简单序列重复区间（ISSR）,SRAP等3种标记,以SRAP标记每对引物扩增的位点数及每对引物扩增的多态性位点数为多,但SRAP多态性引物的比例、多态性位点比例居于另2种标记之间。在山核桃研究中可以考虑使用SRAP及RAPD标记。图6表4参28     

百山祖冷杉SSR体系的建立及人工辅助授粉子代的初步鉴定

应用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取百山祖冷杉Abies beshanzuensis叶片DNA,建立百山祖冷杉简单重复序列（SSR）反应体系。在体系建立过程中,采用单因素法分别对影响聚合酶链反应（PCR）的因素进行分析。结果表明：在20.00 μL反应体系中,模板DNA用量、镁离子（Mg²⁺）浓度、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dNTPs）浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量分别是60 ng,3.75 mmol·L^－1,0.15 mmol·L^－1,0.40 μmol·L^－1,16.67 nkat（1.0 U）时结果最好。随机挑取其中1对引物扩增的多态性片段进行克隆测序,序列经比对后得到的一致性值达到94%,表明其他杉科植物的SSR引物可以在百山祖冷杉中应用。通过引物筛选,得到15对引物可在百山祖冷杉中扩增得到多态性条带,其中4对引物扩增得到的部分片段在百山祖冷杉和日本冷杉Abies firma间有明显区别。这些结果表明,利用SSR分子标记技术能够用于百山祖冷杉人工辅助授粉子代的初步鉴定。图7表2参16     

光皮桦SSR分子标记体系的建立

采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）-硅珠法提取光皮桦Betula luminifera嫩叶DNA,利用近缘种日本白桦B. platyphylla var. japonica和欧洲白桦B. pendula的引物,建立光皮桦简单重复序列标记（SSR）反应体系。在体系建立过程中,采用单因素法分别对影响聚合酶链式反应（PCR）反应的因素进行分析。结果表明：在20 μL反应体系中,模板DNA用量、Mg²⁺浓度、脱氧核糖核苷酸（dNTPs）浓度、引物浓度、T_aq DNA聚合酶用量分别为60 ng,1.500 mmol·L^－1,0.175 mmol·L^－1,2.500 mmol·L^－1,1.0 × 16.67 nkat时结果最好;引物退火温度比日本白桦扩增时提高1 ℃时效果佳。PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后随机挑取其中3对引物扩增的多态性片段进行克隆测序,对引物的通用性做进一步检验,序列经比对后得到的与原物种序列相似度（max ident值）均在95.0%以上。可见,近缘种日本白桦和欧洲白桦的SSR引物可以在光皮桦上应用。图7表2参17     

麻疯树遗传多样性的相关序列扩增多态性（SRAP）分析

采用相关序列扩增多态性（SRAP）分子标记对中国6省（区）及印度尼西亚共8个麻疯树Jatropha curcas种源样本进行研究,旨在阐明麻疯树种源间的遗传关系和遗传多样性。结果表明：麻疯树相关序列扩增多态性?鄄聚合酶链式反应（SRAP-PCR）最佳反应体系为：10 × PCR buffer 2 μL,DNA模板20 ng,T_aq酶16.67 nkat,Mg²⁺ 2.50 mmol·L^－1,三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）120.00 μmol·L^－1,引物0.15 μmol·L^－1,总体积为20 μL;并从274对引物中选出具有多态性的45对引物,共检测出500条清晰的条带,其中多态性条带141条,占总条带数的28.20 %。非加权成对算术平均法（UPGMA）聚类分析及主成分分析表明,各个种源间的亲缘关系均很近,其相似系数为0.791 ~ 0.940,8个种源被聚为3类,其中印度尼西亚种源单独聚为1类,来自不同地域的7个中国种源被混聚为另外2类。图6表3参16     

厚朴AFLP分子标记体系的建立

以厚朴 Magnolia officinalis为材料,通过对扩增片段长度多态性（AFLP）反应体系中的酶切模板用量、扩增条件等几个方面进行优化,建立了较为理想的厚朴AFLP反应体系。结果表明：①采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）硅珠法提取的DNA质量较好,适用于AFLP分析。②酶切的基因组DNA以400 ng为宜;预扩增产物的稀释倍数以30倍为宜;20.00 μL选扩反应体系中Mg²⁺最佳浓度为2.00 mmol·L^－1,三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）最佳浓度为0.225 mmol·L^－1,Taq DNA 聚合酶最佳用量为16.67 nkat时,扩增带清晰且稳定,扩增效果较好。旨在为研究厚朴天然种群的遗传多样性及遗传结构分析、新品种选育及鉴定和遗传图谱构建等奠定理论基础。图7表1参12     

石榴ISSR-PCR反应体系的优化研究*

 以酸绿籽石榴为试材,对ISSR反应体系中的各个主要影响因子进行优化筛选。结果表明：25 μL　ISSR反应体系各组分的最适浓度分别为：1×buffer（不含Mg²⁺),1.5 mmol/L Mg²⁺,0.2 mmol/L dNTPs,TaqDNA聚合酶1.5 U,引物0.3 μmol/L,模板40ng。反应程序为：94 ℃预变性4 min,94 ℃变性45 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,40个循环,最后72 ℃延伸10 min。该体系的建立为从DNA分子水平进一步研究石榴种质资源遗传多样性、系统分类、品种鉴定奠定基础。     

毛竹种子萌发和幼苗生长对铝胁迫的反应

为研究毛竹Phyllostachys pubescens耐铝性，以毛竹为材料并对照耐铝性不同的2种水稻Oryza sativa品种（敏感型IR1552和耐受型Azucena），通过不同铝浓度对毛竹及水稻种子发芽率、根长的影响，及对其幼苗根伸长量、丙二醛质量摩尔浓度和植物胁迫保护酶超氧化物歧化酶、过氧化物酶的影响，来确定毛竹耐受性。结果表明，毛竹种子耐铝浓度为200 μmol·L^－1，在达到500 μmol·L^－1时，开始出现显著抑制现象，2 000 μmol·L^－1时达到半致死浓度，种子耐铝程度低于铝敏感型水稻品种IR1552；毛竹幼苗在500 μmol·L^－1浓度铝处理下，1 d即出现根伸长显著被抑制现象，且3 d后抑制加深，而敏感型IR1552则能在第3 天时恢复生长。毛竹幼苗经铝胁迫3 d后超氧化物歧化酶活性变化不显著（P = 0.1531），过氧化物酶活性变化显著（P = 0.018 0），而2个品种水稻均为极显著，且相对于水稻，在对照未加铝处理的毛竹苗根系中过氧化物酶活性和丙二醛质量摩尔浓度均较高。总而言之，毛竹耐铝程度低于水稻敏感型IR1552，在植物界中属于中等耐铝水平。图3表3参29     

维生素C及植物生长调节物质对油茶花粉萌发率的影响

以油茶‘华硕’Camellia oleifera‘Huashuo’花粉为试材,运用琼脂培养基萌发法研究维生素C（AsA）及植物生长调节物质对油茶花粉萌发率的影响。结果表明：适宜质量浓度的维生素（CAsA）,吲哚乙酸（IAA）,萘乙酸（NAA）,2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和赤霉素（GA₃）对油茶花粉萌发率具有显著促进作用,其中单因素处理AsA质量浓度为20 mg·L^-1时,花粉萌发率达到最高（65.86%）,比对照提高了23.80%;GA₃质量浓度为10 mg·L^-1时花粉萌发率最高,达74.22%;NAA和2,4-D处理花粉萌发率在质量浓度为1.0 mg·L^-1时最高,分别达到61.33%和60.09%,IAA在质量浓度为5.0 mg·L^-1时花粉萌发率达到最大（71.52%）;适宜质量浓度的IAA,GA₃和AsA配合使用能显著提高油茶花粉萌发率。根据适宜质量浓度设计3因素4水平正交实验,发现以5.0 mg·L^-1 IAA + 5.0 mg·L^-1GA₃ + 20.0 mg·L^-1AsA最优,油茶花粉萌发率达到82.91%。图3表3参13     

万寿菊SS-PCR反应体系的优化

实验材料为色素万寿菊雄性不育两用系'9901AB',通过对SSR-PCR反应体系中的主要因素dNTPs、引物及模板DNA进行最优条件筛选,建立了适合于万寿菊雄性不育两用系的SSRPCR反应体系:2.5μL 10×buffer、40 ng模板DNA、2μL 10μmol·μL1引物、1.0 U Taq酶、1.2μL2.5...     

亚麻RAPD的反应体系优化及引物筛选

对亚麻RAPD反应条件进行了优化：在25μL反应体系中,含10×Buffer,Mg^2＋（1mmol·L^-1）,Taq酶1U,Ge-nome DNA 50ng,dNTP0．25mmol·L^-1,RAPD primer 1．5／μmol·L^-1。PCR反应程序为：94℃预变性4min;94℃变性40s,37℃退火1min,72℃延伸90s。40个循环;72℃延伸10min。同时利用3个有代表性的亚麻品种从70条引物中筛选出12条多态性好、重复性高的引物,为亚麻的分子鉴定奠定了基础。     

葡萄基因组DNA的提取及RAPD条件优化

采用改良CTAB法提取葡萄属22种植物的基因组DNA,对其完整性进行了测定,通过单因素五水平试验,筛选模板、Mg2+、Taq酶、dNTPs和随机引物的浓度及其用量,建立了葡萄RAPD技术最优体系,即25 μL体积中模板DNA为40 ng·μL-1,MgCl２ 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.8 mmol·L-1,Taq DNA 聚合酶1 U·μL-1,引物 0.8 μmol·L-1,建立了葡萄基因组DNA的RAPD 反应扩增程序,即94℃预变性4 min, 94℃循环变性 45 s,37℃退火 55 s,72℃ 延伸 80 s,40个循环,最后72℃ 延伸10 min。     

大明竹属部分植物ISSR-PCR反应体系优化及有效引物筛选

采用单因素试验方法,建立了适合大明竹属25个竹种的ISSR-PCR反应体系,优化了各影响因子的用量,筛选出18条有效引物,并确定它们的退火温度,最后对体系进行了检验.优化后大明竹属植物ISSR-PCR的20 μL反应体系含2.0 μL10×PCR Buffer、2.5 mmol·L-1 Mg2＋、0.15 mmol·L-1 dNTPs、0.5 μmol·L-1引物、1.0 U Tap DNA聚合酶、50 ng模板DNA、10.6μL灭菌ddH2O.扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性60 s,55℃复性45s,72℃延伸90 s,循环40次;72℃延伸7min,4℃保存.该ISSR-PCR反应体系可用于大明竹属部分植物的遗传多样性及遗传结构研究.     

胡萝卜ISSR反应体系优化的研究

以改良CTAB法提取胡萝卜基因组DNA作为ISSR-PCR模板,通过单因素试验建立了一套适合胡萝卜ISSR-PCR的优化的反应体系,即25μL反应液中含10×buffer2.5μL,2.0mmol.L-1Mg2＋,200μmol·L-1dNTPs,Taq酶1.5U,引物0.5μmol·L-1,DNA模板20ng。PCR扩增程序为：94℃预变性4min,94℃变性40s,48～58℃退火45s,72℃延伸2min,进行35个循环,72℃延伸8min,在16℃保存。应用该优化反应体系筛选出了24条有效引物。     

银杏ISSR-PCR扩增反应体系的优化

为了对影响银杏戗ngkobiloba简单序列重复区间扩增-聚合酶链式反应（ISSR-PCR）扩增反应体系的因素进行优化,采用[SSR-PCR扩增技术和UVP凝胶电泳成像技术对模扳DNA浓度、Taq酶用量、引物用量、dNTP的用量以及退火温度等因素进行筛选和优化筛选优化后的反应条件：Taq酶0．3μg,2μL10×Buffer（含15mmol·L^-1 MgCl2）,模板DNA40ng,dNTP0．2mmol·L^-1,引物0．5μmol·L^-1,Mg^2＋,5nmol·L^-1。PCR扩增程序：94℃变性5min,然后进行38个循环：94℃变性30S,48～53℃（根据引物而定）退火30s,72℃延伸1min;最后72℃延伸10min,4℃终止反应。上述反应条件可广泛应用于银杏的遗传多样性分析、遗传育种和转基因等方面的研究。图6表1参19     

Establishment and Optimization of SRAP Amplification System in Lonicara caerulea L.

A single factor design was applied to optimize five factors influencing SRAP system, including Taq DNA polymerase, template DNA concentration, dNTPs, primer and Mg2＋, each at four levels. The optimal SRAP-PCR system for Lonicera caerulea L. was 20 ktL SRAP-PCR amplification reaction solution containing 2.0 μL 10×PCR buffer, 1.0 U Taq DNA polymerase, 30 ng template DNA, 0.2 mmol·L-1 dNTPs, 2.0 mmol·L-1 Mg2＋ and 0.2μmol·L-1 primer. The suitable amplification procedure consisted of an initial denaturation at 94℃ for 5 min; denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 35℃ for 1 rain, extension at 72℃ for 90 s and in total five cycles; denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 50℃ for 1 min, extension at 72℃ for 90 s and in total 35 cycles; extension at 72℃ for 8 rain; preservation at 4℃. The procedures and systems could meet the demand for SRAP amplification of Lonicera caerulea L. and would play an important role in Lonicera caerulea L. germplasm identification and genetic diversity analysis.     

巨竹ISSR反应体系的建立与优化

以巨竹叶片提取的基因组DNA为材料,用引物UBC810(序列为GAG AGA GAG AGA GAG AT)研究了PCR反应体系的主要成分、退火温度及循环次数对该种植物ISSR扩增结果的影响。结果表明,20μL的反应体系含40 ng模板DNA、0.6μmol.L-1引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,2.5 mmol.L-1Mg2+,0.25 mmol.L-1dNTPs,1×Buffer。PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,54.5℃复性30 s,70℃延伸90 s,循环40次;72℃延伸10 min,置4℃保存。     

与苦丁茶冬青雄性性状连锁的RAPD标记

通过正交试验设计对影响苦丁茶冬青RAPD-PCR反应的5种因素4水平进行优化试验,最终确定苦丁茶冬青RAPD—PCR的最佳反应体系为：在25μL反应体系中,DNA模板20ng,Mg2＋ 2．5mmol·L-1,引物浓度为0．3μmol·L-1,Taq聚合酶浓度为2．0U,dNTPs浓度为200μmol·L-1。最佳的RAPD-PCR扩增程序为：94℃预变性5min,然后94℃变性30s,36℃退火30s,72℃延伸120s,进行40个循环,最后72℃延伸10min;4℃保存。然后通过RAPD技术筛选了91条随机引物,共计有24条引物能在雌／雄DNA／样品池间显示多态性,其中引物S164和S191分别扩增得到2个雄性特异标记S164—900和S191—800。经多次重复实验,RAPD标记均能在雄性个体中稳定出现,故此标记可应用于苦丁茶冬青性别的早期鉴定。