ZmPti1基因正义和RNAi表达载体的构建及其转化玉米的研究

构建了ZmPti1基因的正义表达载体和RNAi载体,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的两个表达载体分别转化到玉米自交系178.收获的种子播种于营养钵中,出苗后,经0.1%的草丁膦筛选得到40株草丁膦抗性植株,进一步用PCR鉴定与PCR-Southern检测得到33株转基因植株,其中15株是转化正义表达载体的转基因植株,18株是转化RNAi表达载体的转基因植株.并对转化方法和ZmPti1基因的功能进行了讨论.     

小麦籽粒胚乳中淀粉分支酶基因的RNAi表达载体的构建及表达

构建sbe2b的RNAi表达载体,并对其转化烟草,检测其对直链淀粉合成的影响.利用网络数据库http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/,确定小麦胚乳淀粉分支酶sbe2b的部分基因序列作为RNAi的目标序列,通过RT-PCR方法从小麦籽粒胚乳中成功克隆出了小麦胚乳中淀粉分支酶sbe2b基因...     

隐花色素CRY2基因片段克隆及RNAi植物表达载体的构建

隐花色素是植物向光反应的主要的光受体,介导蓝光／近紫外光调控的反应。在拟南芥中CRY2调节去黄化反应并控制开化时间。我们根据在GenBank中已经发表的拟南芥（NM_100320）、中国大白菜（AY176689）、油菜（AJ889779）CRY2基因的cDNA保守序列设计并合成同源引物。通过RT—PCR方法从“津田”芜菁（Brassica rapa L．subsp．rapa“Tsuda”）总RNA中扩增出CRY2基因的cDNA部分片段,采用gateway技术中的BP反应将其克隆到pDONR221中。测序表明,该片段与拟南芥具有87％的同源性,与油菜和中国大白菜的同源性达97％以上。采用gateway技术中的LR反应,以植物表达载体pH7GWIWG2（I）为基础,构建了由组成型启动子35S调控的CRY2基因的ihpRNAi植物表达载体。     

牡丹ACS基因片段的克隆及反义植物表达载体构建

根据GenBank登录的牡丹ACS基因DNA全长序列(FJ769773),设计一对特异性引物,在优化的PCR扩增体系的基础上,应用高保真DNA聚合酶KOD-Plus从洛阳红牡丹叶片总DNA中扩增出牡丹ACC合成酶基因片段PsACS-4。测序结果表明:克隆序列长970 bp,不包含牡丹ACS基因内含子序列,与目标序列同源性达100%;用SacI和SmaI对重组质粒和空载体pBI121双酶切、连接,将PsACS-4基因片段反身插入到植物表达载体pBI121的35S启动子下游,成功构建了牡丹ACS反义基因植物表达载体。     

亚麻MS2-F基因的RNAi表达载体构建

亚麻雄性不育相关基因MS2-F在亚麻花粉发育过程中起重要的作用。为了研究其功能,构建了2个RNAi载体。选定该基因的2个不同的片段,分别以正向和反向插入到pHANNIBAL载体中PDK intron的两侧,以形成hpR-NA表达盒。然后将hpRNA表达盒插入到pART27的NotⅠ酶切位点上,成功构建了2个亚麻MS2-F基因的RNAi载体。最后将载体导入到农杆菌LBA4404中。RNAi载体成功构建,为验证MS2-F基因在亚麻花粉发育过程中的生物学功能奠定基础。     

美洲黑杨CCoAOMT基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

据已报道的CCoAOMT(caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase)基因的eDNA序列设计一对兼并引物,从美洲黑杨当年生嫩枝的次生木质部中提取总RNA,通过RT-PCR的方法获得约750 bp的特异性扩增产物.测序结果显示,克隆的序列与GenBank中注册的CCoAOMT基因cDNA同源性最高达99%.该基因的cDNA序列已在GenBank上登录(登录号:EF153198).将克隆的美洲黑杨CCoAOMT基因的cDNA序列反向连接到植物表达载体pBI121中CaMV35S启动子的下游,成功构建了美洲黑杨CCoAOMT基因的反义表达载体pBI-CCoAOMT,为进一步通过反义技术降低杨树木质素含量奠定了基础.     

花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制植物籽粒中蛋白质/油脂含量比例的关键酶.本研究利用RT-PCR技术,克隆PEPCase基因的片段,并将克隆的PEPCase基因片段反向连接替代植物表达载体PBI121的GUS基因.从花生栽培品种荔蒲大花生基因组中克隆获得编码PEPCase的基因片段(886 bp),其核苷酸序列与已报道的花生(EU391629)、棉花(AY008939)、大豆(D10717)、拟南芥(AY210895)、豌豆(D64037)PEPCase基因对应部分的同源性分别为99.77%,84.37%,81.54%,81.25%,78.71%,说明我们得到PEPCase基因片段较准确.构建的反义表达载体中PEPCase基因由35S启动子所控制,将构建的反义表达载体命名为pBGPEP.为通过反义抑制技术提高花生含油量提供了基因及表达载体.     

芒果MinSPS1基因的克隆及表达载体的构建

蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)既是调控蔗糖合成的关键酶又是限速酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机理,本研究从芒果果肉中克隆得到一个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPS1,其cDNA全长序列为3 344 bp,开放阅读框为3 168 bp,编码1 055个氨基酸,蛋白质分子量为118.13 k D,等电点为6.08,对MinSPS1基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与柑橘具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示在完熟期贵妃芒果肉中表达量较高,而在青熟期表达量较低。本研究为深入了解芒果蔗糖合成的分子机理,进一步构建了p CAMBIA1301-MiSPS1过表达载体,为MinSPS1的功能鉴定提供理论依据。     

同源重组快速构建百合LCHS2基因RNAi表达载体及其鉴定

为探讨CHS基因的下调表达对花朵着色的影响以及为百合观赏性状遗传改良提供技术支持,利用基于同源重组原理的Gateway技术,根据课题组从东方百合‘索邦’分离的LCHS2基因序列(Genbank登录号:GQ483376)和pENTR/D-TOPO载体要求,设计上游5'端添加'CACC'的一对特异引物,PCR扩增获得636 bp的干扰片段。通过TOPO克隆,将该片段克隆入载体pENTR/D-TOPO构建入门克隆载体pENTR/D-CHS,测序结果显示,与原序列同源性为100%。再经过LR反应使pENTR/D-CHS上的干扰片段替换掉目标载体pHellsgate12上的ccdB片段,快速构建了包含LCHS2基因干扰片段的RNAi表达载体pH12-CHSi,经限制性内切酶XhoI、XbaI酶切鉴定获得724 bp和722 bp的片段,与预期结果一致。pH12-CHSi电击法转化农杆菌GV3101,菌液PCR鉴定,出现636 bp的目的条带,表明RNAi表达载体pH12-CHSi已成功转入农杆菌。     

香稻PRO基因的克隆及表达载体的构建

利用逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在水稻中特异性表达的脯氨酸氧化酶(PRO)基因.DNA序列分析表明,所获得水稻的PRO cDNA的最大开放阅读框序列全长为1 428 bp,可编码476个氨基酸.该序列与NCBI网站上已发表的PRO基因100%相似.为了能进一步验证所克隆的序列是我们所需的目的基因,成功构建了PRO基因超表达载体和PRO基因干涉载体,便于导入水稻中进行基因的功能鉴定.     

草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建

为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。     

农杆菌介导的sbe2a基因RNAi载体对玉米遗传转化的研究

将淀粉分支酶基因sbe2a的RNAi表达载体转入玉米自交系H99和丹598胚性愈伤组织。探讨了不同菌浓度、不同侵染时间和不同的共培养时间对玉米转化率的影响,确定了最佳转化条件:菌液浓度OD600值为0.5～0.7,侵染时间为25min,共体培养时间为3d。对转化的愈伤组织分化诱导出苗后进行PCR检测,获得了2株阳性植株,初步证明外源基因已经整合到玉米的基因组中。     

草果AtNCED基因克隆、表达和植物表达载体构建

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)是ABA生物合成的限速酶。诸多研究表明NCED基因表达量的变化与ABA含量显著相关,在种子休眠过程中发挥重要作用。为探究草果AtNCED基因的序列特征和功能,本研究以草果(Amomum tsaoko Crevost et Lemarie)种子转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了一个AtNCED基因。该基因全长2 372 bp,包含一个1 830 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码610个氨基酸。生物信息学分析显示,AtNCED基因编码的蛋白在N-末端包含典型的叶绿体转运肽序列,在催化结构域含有4个高度保守的组氨酸残基。AtNCED蛋白与芭蕉科马来西亚蕉同源性较高,与其他单子叶植物处在同一进化分支。实时荧光定量PCR分析结果表明,AtNCED基因表达量随着层积时间的增加逐渐下降,该基因可能正向调控种子休眠,在草果种子休眠诱导与维持中发挥重要作用。进一步地,利用同源重组方法,成功构建了pBI121-AtNCED过表达载体,并转化至农杆菌EHA105。该研究结果为弄清ABA激素信号在种子休眠中的调控作用提供了帮助。     

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD6的克隆及正义、反义与RNAi干扰载体的构建

肉桂醇脱氢酶(CAD)催化木质素单体合成的最后一步反应,将肉桂醛还原生成相应的肉桂醇.采用PCR方法从棉花中克隆了GhCAD6基因1 569 bp的基因组序列,序列分析表明GhCAD6基因由5个外显子和4个内含子组成.为了研究GhCAD6基因的功能,构建由棉纤维组织特异性启动子E6驱动的GhCAD6基因正义、反义表达载体;同时克隆了GhCAD6基因的一段417 bp高度保守的NBD区序列,构建了GhCAD6基因的RNAi干扰载体,并将上述载体转入农杆菌菌株LBA4404中.为通过转基因技术深入研究GhCAD6基因在棉纤维发育和木质素代谢途径中的作用创造条件.     

葡萄糖氧化酶基因植物表达载体的构建

为进一步开展转基因研究创造条件,用限制性内切酶将葡萄糖氧化酶(GOD)基因从pMD/GO载体上切下,定向连接到植物表达载体pROKⅡ的CaMV35S启动子下游和NOS终止子上游,成功地构建了GOD基因植物表达载体pROK/GO。利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,提取转化质粒,经PCR和酶切鉴定表明,GOD基因植物表达双元载体构建成功。     

马铃薯块茎糖基转移酶基因的克隆及其RNAi载体的构建

为探讨鼠李糖基转移酶(rhamnosyltransferase, sgt3)基因与类固醇糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloid, SGAs)合成关系, 揭示sgt3基因在SGAs合成中的作用, 本研究根据GenBanK No：DQ266437保守区设计特异引物, 通过RT-PCR技术获得马铃薯块茎sgt3相似基因;采用生物信息学相关软件分析, 预测sgt3相似基因cDNA序列编码的蛋白质结构和功能, 构建基于sgt3基因的植物干扰表达载体。结果表明, 克隆的sgt3相似基因与报道的sgt3基因序列相似性达到99.54%, 其ORF长1 500 bp, 编码505个氨基酸残基, 具有UDPG糖基转移酶保守结构域及许多重要功能位点;三级结构预测表明, 该氨基酸同糖基转移酶单体结构模型相似, 为糖基转移酶家族成员, 表明可能具有合成类固醇糖苷生物碱功能, 基因序列已注册到GenBank, 序列登录号为HM188447。以此为靶序列, 构建由Actin启动子和CIPP启动子驱动的与sgt1和sgt2基因相似度高的含有sgt3基因序列的干扰表达载体, 将为糖苷生物碱的合成、代谢的进一步研究及低糖苷生物碱转基因马铃薯品种的培育奠定基础。