日本血吸虫重组IAP蛋白的免疫保护效果评估

为研究日本血吸虫凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP）重组蛋白诱导BALB/c小鼠的免疫保护效果,利用PCR技术扩增SjIAP基因,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-SjIAP,诱导表达重组SjIAP蛋白,并利用重组蛋白制备兔源多克隆抗体血清。然后,选用SjIAP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性抗体水平,以及免疫小鼠脾脏淋巴细胞在SjIAP重组蛋白刺激后产生的细胞因子水平。强化免疫后,将小鼠进行血吸虫尾蚴攻虫试验,感染38 d,进行剖杀,计算虫体减虫率及肝脏减卵率。Western blot结果表明本研究制备的兔源多抗血清能特异性识别SjIAP重组蛋白。ELISA检测表明免疫SjIAP重组蛋白可诱导较高水平的IgG及IgG亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。动物试验表明,免疫SjIAP重组蛋白的小鼠与PBS组相比分别获得了31.5%的减虫率和37.2%的肝脏减卵率。免疫SjIAP重组蛋白能诱导小鼠获得一定减虫和减卵保护效果,提示血吸虫凋亡蛋白抑制因子可作为抗血吸虫病的疫苗候选分子。     

大片形吸虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A的原核表达及不同时期表达水平分析

【目的】克隆大片形吸虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A(Ser/Thr protein phosphatases 2A,PP2A)基因并构建原核表达载体,获得原核表达蛋白,为探究PP2A基因功能及其在大片形吸虫的发育中的作用奠定基础。【方法】提取大片形吸虫成虫虫体组织总RNA,应用RT-PCR方法扩增PP2A基因的完整编码区序列,并以双酶切的方式连接pET-28a(+)载体;经酶切、测序鉴定后获得阳性质粒pET-28a-PP2A,将pET-28a-PP2A重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化;通过SDS-PAGE及Western blotting检测大片形吸虫PP2A基因的表达效果;应用实时荧光定量PCR检测PP2A基因在大片形吸虫虫卵、囊蚴、6周龄童虫和成虫阶段中的表达情况。【结果】克隆的大片形吸虫PP2A基因编码区序列长1 161 bp,编码386个氨基酸,分子式为C₁₉₈₀H₃₁₀₅N₅₃₅O₅₆₆S₂₄,分子质...     

日本血吸虫GSK3蛋白编码cDNA的克隆、表达及其重组蛋白的免疫保护研究

本研究利用生物信息学分析了日本血吸虫(Schistosoma japonicum,sj)Glycogen synthase kinase 3(GSK3)蛋白,并对其中一个GSK3蛋白的编码cDNA进行了克隆和原核表达,制备了特异性的多克隆抗体.同时,还初步评估了重组蛋白的免疫保护效果.生物信息学分析表明在日本血吸虫数据库存在两种GSK3蛋白,且其中一个SjGSK3在日本血吸虫不同发育时期均有转录.Western blot结果表明本研究制备的抗体能特异性识别日本血吸虫SjGSK3重组蛋白,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性.动物实验表明免疫SjGSK3重组蛋白的动物与佐剂对照组比较分别获得了平均10.6％减虫率和40.5％肝脏减卵率.     

日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区cDNA片段的克隆表达及其免疫保护功能

本研究根据曼血吸虫抱雌沟蛋白（Gyncophoral canal protein)基因SmGCP保安区片设计－对引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用TR－PCR法扩增出一大小为868bp的基因片段。测序后分析序列推断该片段与SgGCP相应片段碱基同源性86．6％。说明所克隆的基因为编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因,推断的氨基酸序列同源性为84．1％,将其克隆到表达载体pET28（a)中,在大肠杆菌BL21中获得了较高量的融合表达,表达产物分子量为29KD。利用因吸虫成虫粗抗原免疫大白兔所得抗血清对该表表达产物进行Westernblto检测,在预测位置出现了明显的识别条带,显示了该表达产物良好的抗原性。将该表达产物用佐剂处理免疫昆明系小鼠攻击血吸虫尾蚴,7周后剖杀小鼠冲虫,进行成虫和虫卵计数,其数虫率为35．2％,减卵率为37．8％,与对照组比较差异显著,初步证明血吸虫抱雌沟蛋白具有一定的免疫保护功能。     

日本血吸虫还原性辅酶I(SjNADH)基因的克隆表达及其免疫保护效果分析

为了评估日本血吸虫还原性辅酶I(SjNADH)在小鼠体内诱导的免疫保护效果,应用PCR获得SjNADH基因片段,其开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸,并在大肠杆菌中成功表达,纯化得到该重组蛋白。Western blot结果显示,SjNADH在日本血吸虫童虫和成虫中的表达量稳定,SjNADH融合蛋白也能被免疫血清识别,具有较好的免疫原性。应用重组蛋白免疫小鼠能诱导产生较高的特异性抗体水平,并诱导了20.13%的减虫率和23.06%的肝脏减卵率。结果表明,获得的SjNADH重组蛋白在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护,有作为血吸虫疫苗候选抗原分子的潜力。     

日本血吸虫基因重组抗原rSj06868对小鼠的免疫保护效果

为克隆、表达日本血吸虫假想蛋白SJCHGC068068编码基因（暂命名为Sj06868）并观察重组抗原的免疫预防效果。应用PCR技术从日本血吸虫7 d童虫、14 d童虫mRNA反转录制备的cDNA中克隆到Sj06868基因的46-438 bp DNA片段,BLASTn分析未发现其他物种中的同源性序列,也未发现其保守序列和相关功能结构域。以pET32a为表达载体、Sj06868基因在大肠杆菌Rosetta（DE3）中获得高效表达,表达产物rSj068068分子量为36 kDa,能被感染血吸虫14 d兔血清识别。将纯化的重组抗原与佐剂ESSAI ISA 206 CELL混合后免疫BALB/c小鼠,与佐剂对照组和PBS对照组相比,分别获得了31.63%、29.19%减虫率以及55.63%、56.27%肝脏虫卵减少率。用ELISA检测各组血清中抗rSj068068特异性抗体结果显示,免疫组在攻击感染前、佐剂对照组和PBS对照组在感染后均产生了较高水平的特异性抗体。本研究结果说明,Sj068068是日本血吸虫特有的童虫期高表达基因,rSj068068在抗血吸虫疫苗和血吸虫感染的诊断方面均有潜在应用价值。     

日本血吸虫SjZFP1181-786 bp基因序列编码蛋白的免疫保护效果评估

根据日本血吸虫锌指蛋白SjZFP1的抗原位点预测结果,选取编码基因中抗原表位富集的181~786 bp核苷酸序列(SjZFP1-1)表达制备重组蛋白抗原rSjZFP1-1/His,构建重组真核表达质粒pcDNA-SjZFP1-1,并开展动物免疫实验,评估免疫保护效果。在两次独立的免疫实验中,与相应对照组相比,rSjZFP1-1/His单独免疫组以及pcDNA-SjZFP1-1与rSjZFP1-1/His联合免疫组均产生较高水平的特异性抗体,但平均虫负荷、肝脏虫卵数无显著性减少。研究结果显示rSjZFP1-1/His不能诱导有效的抗感染免疫,今后可进一步开展SjZFP1蛋白N-端肽段编码序列的表达和效果评估。     

日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆和分析

为筛选新的有潜在保护性的抗原分子编码基因，采用重复感染兔血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，将阳性克隆的插入序列进行了PCR扩增和序列分析。结果发现，所筛选的阳性克隆中有2个为日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(SPI)。序列分析表明，它可编码分子质量为4．6ku，等电点为5．76的蛋白，与GenBank中日本血吸虫SPI基因(大陆株)、曼氏血吸虫SPI基因和埃及血吸虫SPI基因编码的氨基酸序列的同源性分别为98％、62％和62％。TMpred分析表明，该蛋白具有2个明显的跨膜区即36～55和356～372位氨基酸。     

编码日本血吸虫CIAPIN1 cDNA的克隆及其重组蛋白的原核表达

本研究利用生物信息学并结合分子生物学实验对日本血吸虫细胞因子诱导凋亡因子CIAPIN1（cytokine induced apoptosis inhibitor 1）基因进行了初步研究。研究表明日本血吸虫存在CIAPIN1同源基因,将其命名为SjCIAPIN1,SjCIAPIN1基因已知cDNA长1143 bp,包括完整的CDS,编码276个氨基酸,预测分子量为30.55863 kDa。通过原核表达系统对该蛋白进行了重组表达和纯化,并制备了多克隆抗体制备。Western blot分析表明,本研究制备的多克隆抗体能与SjCIAPIN1重组蛋白特异识别。     

日本血吸虫多价核酸疫苗的构建及免疫保护试验

利用PCR技术获得日本血吸虫GST抗原基因,通过分子克隆技术将GST、FABP基因克隆至pVAX1载体,并将其克隆至舍有Sj23基因表达核的plRESneo栽体,构建重组质拉pVAX-GST、pVAX-GST-FABP、pIRESneo-Sj23和pIRESneo-GST-FABP-Sj23.将50只昆明小鼠随机分成5组,每组10只,分别以肌肉注射质粒pIRESneo-GST-FABP-Sjz3、plRESneo-Sj23、pVAX-GST、pVAX-GST-FABP和空白质粒plRESneo,50μg/只,免疫2次,每次间隔21 d.测定小鼠免疫前后血清抗体水平,30 d经腹部皮肤感染血吸虫尾蚴,45 d后剖杀小鼠,计数各组小鼠虫卵数及成虫数.结果表明.重组质粒pVAX-GST、plRESneo-Sj23、pVAX-GST-FABP和pIRESneo-GST-FABP-Sj23均能诱导小鼠产生特异性的IgG抗体,plRESnecrGST-FABP-Sj23免疫组所诱导的IgG水平最高;减虫率分别为26.1%、30.8%、33.2%和47.5%,减卵率分别为25.4%、45.0%、48.4%和69.8%.pIRESneo-GST-FABP-Sj23的减卵率和减虫率明显高于其他DNA疫苗.结果表明,日本血吸虫多价核酸疫苗能产生较强的免疫反应,并能获得较好的免疫保护效果.     

日本血吸虫蛋白质组学研究进展

随着日本血吸虫(Schistosoma japonicum)基因组学的发展,应用双向电泳、质谱分析及生物信息学分析开展的蛋白质组学研究正成为日本血吸虫研究的前沿领域。生物体中的基因是相对稳定,但是蛋白质的活动随着生命活动的进行表现出动态的变化,并具有对外界环境发生反应的能力。对日本血吸虫进行蛋白质组学方面的研究,能直接地反映其生理功能的过程。这些研究为研制开发抗日本血吸虫病疫苗、新型治疗药物提供了新的途径。论文从日本血吸虫童虫部分差异表达蛋白、成虫蛋白质的性别差异性、药物相关蛋白组学、免疫蛋白组学等方面,对日本血吸虫蛋白质组学研究做了概述。     

IL-18增强日本血吸虫DNA疫苗Sj23的免疫保护效果

将小鼠IL-18基因和日本血吸虫Sj23膜蛋白基因分别插入pVAX1载体,构建真核表达质粒pVAX/mIL-18和pVAX/Sj23,联合或单独免疫小鼠,以pVAX1空载体作对照,免疫2次,间隔2周,2次免疫后4周攻击日本血吸虫尾蚴.体液和细胞免疫检测结果表明,联合免疫组能诱导小鼠产生较强的抗日本血吸虫成虫可溶性抗原(SWAP)IgG,较高水平的IFN-γ和IL-2.攻虫试验表明,联合免疫小鼠成虫减虫率和肝脏减卵率分别达41.6%和49.4%,明显高于pVAX/Sj23单独免疫组(减虫率和肝脏减卵率分别为26.5%和41.4%).以上试验结果表明,IL-18能明显增强Sj23 DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答,并且产生较强的保护作用.     

日本血吸虫信号转导蛋白sjwnt10a基因的克隆及其在童虫和成虫中mRNA表达量的变化

利用RACE技术从19日龄的日本血吸虫童虫中扩增了1个Wnt家族基因，并对其进行了生物信息学分析。同源性分析表明，该基因为日本血吸虫新基因，完整开放阅读框（ORF）长1896bp，编码631个氨基酸，理论分子质量为73．3ku。该基因编码的氨基酸序列具有wnt家族蛋白的典型特征，与人、鼠Wnt10a的氨基酸序列同源性均为26％，推测为血吸虫的Wnt10a基因，命名为Sjwnt10a（GenBanK登录号DQ643829）。利用实时荧光定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况，结果显示该基因在19日龄的日本血吸虫童虫中表达量最高，在14日龄童虫和44日龄雄虫中也有表达，但分别仅为19日龄童虫表达量的8．8％和5．0％，而在31日龄成虫和44日龄雌虫中没有检测到该基因。结果提示，童虫差异表达的Sjwnt10a基因可能对童虫的生长、发育至关重要。     

日本血吸虫保护性单克隆抗体SSj14识别模拟表位的筛选及其免疫原性分析

为分析日本血吸虫保护性单抗SSj14的模拟表位,观察其免疫保护作用,利用SSj14单抗筛选富集噬菌体的随机六肽库,应用免疫印迹法确定阳性克隆并分析其核苷酸序列,采用竞争ELISA法分析阳性克隆的抗原性,用筛选的阳性噬菌体克隆免疫小鼠进行日本血吸虫病免疫保护试验,计算减虫效果,并用ELISA法检测小鼠免疫前后的特异性抗体水平。结果显示,经3轮富集筛选后,免疫印迹法鉴定到4个阳性克隆,它们对SSj14单抗的抑制率分别为20.0%、40.8%、58.6%、61.5%,并分别在小鼠中诱导了7.42%、9.43%、11.74%、22.30%的减虫率。用噬菌体克隆免疫的小鼠均产生了较高水平的特异性抗体。结果表明,筛选到的阳性噬菌体克隆和SSj14单抗有较高的亲和力,并诱导了抗小鼠日本血吸虫的部分保护效果。     

肝片形明虫 长菲策吸虫及日本血吸虫DNA的多态性检测

本试验用随机扩增DNA多态性技术对肝片形吸虫、长菲策吸虫和日本血吸虫虫体总DNA的多态性进行检测，结果筛选出三条具有种鉴别意义的RAPD谱带。这些特征性条带可望标记成探针用于粪便学检查中虫卵的鉴定。     

阿魏倍半萜类对日本血吸虫作用研究

观察小鼠体内不同发育阶段日本血吸虫童虫与成虫对阿魏倍半萜类的敏感性。用定量日本血吸虫尾蚴感染小鼠,感染2 h,1、3、7、12、14、16、25、35、42 d后分别一次性灌服阿魏倍半萜类500 mg/kg。给药后4周剖检小鼠,采用门静脉灌注法收集虫体,计算减虫率。结果显示,阿魏倍半萜类对1、3、7、12、14、16、25、35、42 d龄童虫或成虫的减虫率分别为16.9%、18.0%、71.3%、50.2%、36.9%、31.3%、45.3%、58.0%、26.4%,其中以7-35 d龄虫对该药最敏感。该结果提示,阿魏倍半萜类对小鼠体内不同发育阶段日本血吸虫均有杀灭作用,对7-35 d龄虫体杀灭效果更为明显。     

羊角拗甙对日本血吸虫虫卵肉芽肿的影响

对人工感染18条日本血吸虫尾蚴的雌性小鼠分别于感染后41 d起灌服羊角拗甙及吡喹酮,观察其对小鼠肝内虫卵肉芽肿和肉芽肿内嗜酸性粒细胞的影响。结果表明,小鼠肝内虫卵肉芽肿平均直径和肉芽肿内嗜酸性粒细胞明显减少,羊角拗甙与吡喹酮对血吸虫虫卵肉芽肿具有明显抑制作用。     

苏云金杆菌晶体蛋白不同给药途径对小鼠体内日本血吸虫的作用

将小鼠人工感染日本血吸虫尾蚴 40条 /只 ,30 d后将苏云金杆菌伴胞晶体蛋白以不同的给药方式 (静脉注射、肌肉注射、灌胃、腹腔注射 )给药 ,用药后 15 d剖检查虫。结果发现 ,各种给药方式对小鼠体内的日本血吸虫成虫均有一定的效果 ,但以静脉注射效果最好 ,肌肉注射次之 ,灌胃和腹腔注射效果较差。这表明苏云金杆菌制剂作用于小鼠体内的日本血吸虫时 ,静脉注射是最佳给药途径。     

3个日本血吸虫新基因的克隆和分析

为获得新的可表达保护性抗原分子的编码基因 ,以重复感染兔血清为探针 ,筛选日本血吸虫成虫 c DNA文库 ,对获得的阳性克隆进行 PCR鉴定并测序后 ,通过互联网将测序结果进行同源性分析 ,并对新基因的编码阅读框及其编码蛋白质的结构及功能进行预测。 3个日本血吸虫新基因 IR1、IR2、IR3在 Gen Bank的登录号分别为 AY1 70 31 3、AY1 73930、AY2 5 1 4 81。 BL AST分析结果表明 ,它们与 Gen Bank中其他基因无显著的同源性。其中 IR3为全基因 ,含897个碱基 ,编码 2 99个氨基酸 ,推测等电点 ( p I)为 6 .0 9,相对分子质量约为 331 90     

日本血吸虫Wnt1基因的鉴定及在不同发育阶段表达水平分析

为研究Wnt信号通路对血吸虫发育的调节作用,本研究克隆鉴定了日本血吸虫的Wnt1基因(SjWnt1).序列分析显示,SjWnt1蛋白具有Wnt信号蛋白家族的结构功能域,但比高等生物的Wnt1少一个保守的Cys.mRNA和蛋白的定量分析结果显示,SjWnt1表达于血吸虫的整个发育过程,而在虫卵和早期童虫中呈高表达水平,提示SjWnt1对卵胚发育和早期童虫的细胞分化具有调节作用.来源于非适宜宿主及单性感染的发育不良虫体中SjWnt1 mRNA水平比发育正常的虫体高,表明不良发育的虫体相应的Wnt信号阻滞.SjWnt1表达下调后则引起Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+通路的相应下游基因的mRNA水平下降,推测SjWnt1可能通过这3种传递途径行使信号传递的功能.