烟草马铃薯Y病毒研究进展

综述了马铃薯Y病毒基因组编码的HC-Pro（蚜传辅助因子）和CP（衣壳蛋白）的功能。     

马铃薯Y病毒广东分离物HC-Pro基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR法对广东烟草样品的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)辅助成分蛋白质(Helpercomponent proteinase,HC-Pro)基因进行了克隆,并对其进行了序列分析。测序结果表明广东PVY HC-Pro(命名为PVY-HC-GD)基因(用PVY-HC-GD表示)全长1 395 bp,编码465个氨基酸。与已报道的PVY HC-Pro基因核苷酸序列相比发现,PVY-HC-GD与PVY NTN株系(PVYNTN)(AB331517)的PVYHC-Pro基因核苷酸序列相似性最高,达99.6%。而氨基酸序列比较表明,PVY-HC-GD与PVY N株系(PVYN)(AM268435)的PVY HC-Pro氨基酸序列相似性最高,为99.1%。进一步将PVY-HC-GD的核苷酸和其编码的氨基酸序列与其他报道的同源基因比对构建了系统关系树,结果显示广东烟草样品中PVY-HC-GD与PVYNTN PVY HC-Pro亲缘关系最近。     

甘蔗花叶病毒辅助成分-蛋白酶基因原核表达及抗血清制备

利用RT-PCR克隆甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV) DWK1分离物辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)基因,酶切后连接原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-HC-Pro。将重组质粒转化大肠杆菌菌株Rosetta,经IPTG诱导后,表达出57 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,多点注射法免疫新西兰长耳兔,制备SCMV HC-Pro抗血清。间接ELISA结果表明,该血清效价为1∶8 192。感染DWK1的玉米叶片病汁液稀释128倍时,该血清仍然能够有效检测出HC-Pro。Western-blot检测结果表明,该血清可特异性检测SCMV第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2,与同属的烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和马铃薯Y病毒(PVY)均无反应。本研究为准确、快速检测SCMV HC-Pro并进一步研究其功能和作用机制奠定了基础。     

鹅细小病毒蛋白研究进展

鹅细小病毒有5种蛋白,包括2种非结构蛋白和3种结构蛋白,该文简述了这5种蛋白的性质、特点、功能,并综述了鹅细小病毒蛋白体外表达研究进展。     

植物转录后基因沉默抑制蛋白研究进展

转录后基因沉默现象广泛存在于植物、动物和真菌中。在植物中转录后基因沉默现象是对外来病毒入侵的一种防御机制。植物病毒既是转录后基因沉默的起始物、靶目标，又是编码抑制转录后基因沉默的蛋白。已经发现3种病毒抑制子作用于转录后基因沉默的不同阶段：烟草蚀刻病毒蛋白（HC-Pro）作用于转录后基因沉默的持续阶段，产生25nt小RNA的上游和产生沉默信号的下游区域；马铃薯x病毒蛋白（P25）和黄瓜花叶病毒蛋白（CMV2b）作用于转录后基因沉默的信号阶段。     

番茄叶绿素a/b结合蛋白基因cab-1a的克隆与定位

在进行酵母双杂交试验时发现,马铃薯Y病毒HC-Pro蛋白与番茄未知蛋白发生相互作用,经测序、Blast比对,确认其为番茄叶绿素a/b结合蛋白Cab-1A,Genebank序列号为XM_010318610.1。为初步验证这一发现,设计引物,然后以番茄c DNA文库为模板,克隆出798 bp的cab-1a全长序列,并构建了cab-1a基因的亚细胞定位载体p SPGFP-Cab-1A,并运用叶盘法将其转化到烟草表皮细胞中,在荧光共聚焦显微镜下观察其定位情况。结果表明,cab-1a基因编码的Cab-1A-like蛋白位于细胞核和细胞质中,为与马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)蛋白HCPro(helper component proteinase)相互作用的后续研究奠定理论基础。     

马铃薯Y病毒属病毒外壳蛋白功能

Potyvirus属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae),是最大的植物病毒属,给农业生产造成严重的经济损失。外壳蛋白(Coat Protein简称CP)是Potyvirus属病毒中相对较稳定、功能较复杂的编码蛋白,涉及到病毒传播、运动、抗性及症状表达。本文详细分析了外壳蛋白的功能,包括参与病毒的蚜传、参与病毒的长距离运动和胞间运动、参与植物病毒病防治和参与病毒症状表达。对病毒蛋白功能的研究为该属病毒的研究发展提供重要的理论基础,对Potyvirus侵染机制及抗病机理研究具有指导价值。     

犬瘟热病毒F蛋白分子生物学研究进展

犬瘟热病毒融合蛋白是囊膜糖蛋白,是产生中和抗体的主要保护性抗原,结构相对保守。融合蛋白介导病毒囊膜和细胞膜融合,决定病毒在宿主体内扩散的能力,在病毒的致病性及免疫原性上具有重要作用。因此,对犬瘟热融合蛋白基因及其蛋白的结构和功能进行研究具有重要的意义。本文从蛋白结构、蛋白功能、核酸序列比对等多方面对融合蛋白进行了阐述。     

小西葫芦黄花叶病毒dsRNA的原核表达及其对ZYMV的防治效果

【目的】小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）是危害西瓜最为普遍的病毒,在西瓜上利用外源喷施病毒基因dsRNA的方法实现对ZYMV的预防和治疗。【方法】首先以实验室已有的ZYMV病毒序列为依据,针对其不同的基因片段,利用NCBI数据库找出与其相似的序列。随后利用软件DNAMAN8对序列进行多重比对分析,找出其保守区域,根据分析结果选择长度介于200—350 bp的ZYMV 3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段,同时选择长度为190 bp的GUS基因片段作为对照。PCR扩增得到这6个片段后,利用同源重组的方法将它们插入到含有双T7启动子的L4440载体中,并利用RNAⅢ酶缺陷型大肠杆菌HT115建立原核表达系统生产dsRNA,采用超声波破碎的方法释放dsRNA,利用TE（10 mmol·L ^-1 Tris-HCl和1 mmol·L ^-1 EDTA）缓冲液溶解dsRNA,最后比较和分析IPTG使用浓度、诱导时间以及超声波破碎时间对dsRNA表达和释放的影响。在西瓜植株上采用喷施的方法施用dsRNA,设计先喷施dsRNA后接种病毒的预防试验和先接种病毒后喷施dsRNA的治疗试验,通过统计分析接种病毒后21 d发病率的方法评价dsRNA预防和治疗ZYMV的效果。【结果】针对ZYMV的3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段以及GUS基因片段建立了能够高效稳定表达和释放dsRNA的生产体系。在IPTG诱导浓度为8 mmol·L ^-1,诱导时间为7 h,在宁波新芝牌超声波细胞破碎仪3ø的档位和60%的输出功率条件下破碎15 min,细胞可以有效产生和释放dsRNA。在对ZYMV的预防试验中发现,喷施GUS基因片段的dsRNA以及TE缓冲液的西瓜植株发病率均为100%的情况下,对ZYMV防治效果最好的是HC-Pro基因片段,接种ZYMV 21 d后防治效果可达到95%,防治效果相对较差的是NIb基因片段,但也可达到80%。在此基础上对HC-Pro片段预防和治疗ZYMV的效果进行了深入分析,结果发现在喷施HC-Pro片段的dsRNA后第3、5、7天接种ZYMV,植株发病率分别为16%、63%、63%,在接种ZYMV后第1、3、5、7天分别喷施HC-Pro片段的dsRNA,无明显的治疗效果,仅起到延迟植株发病的效果。【结论】建立了针对ZYMV不同基因片段的dsRNA原核表达体系,并发现基于HC-Pro基因片段产生的dsRNA对ZYMV防治效果最好,可显著降低植株的发病率、延迟植株发病时间,具有应用潜力。     

基孔肯雅病毒样颗粒的制备

为制备高纯度、均一的基孔肯雅病毒的病毒样颗粒,将基孔肯雅病毒的结构蛋白基因序列(C-E3-E2-6K-E1)人工合成后克隆至杆状病毒-昆虫细胞表达载体中;重组质粒转化DH1OBac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组杆状病毒杆粒;重组杆状病毒杆粒转染ExpiSf9昆虫细胞,包装获得重组杆状病毒,并再次感染ExpiSf9昆虫细胞表达基孔肯雅结构蛋白;通过细胞超薄切片验证杆状病毒的产生,并用流式细胞仪测定病毒滴度;免疫荧光、蛋白免疫印迹分析目的蛋白的表达,透射电镜鉴定病毒样颗粒的形成;最后,通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒样颗粒.结果表明:成功构建了含基孔肯雅病毒结构蛋白的重组杆状病毒杆粒,获得了高滴度的重组杆状病毒,重组杆状病毒表达了基孔肯雅病毒的结构蛋白,结构蛋白自组装成60～70 nm的颗粒.这一研究通过昆虫杆状病毒表达系统成功制备了纯度高和均一性好的基孔肯雅病毒样颗粒,为基孔肯雅病毒的诊断试剂和疫苗研发奠定了基础.