口蹄疫病毒持续感染的黄牛分离毒株VP1和3ABC基因变异特征分析

为明确口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus,FMDV)持续感染与病毒基因变异潜在关系,研究FMDV持续感染分离株结构蛋白VP1和非结构蛋白3ABC基因在牛体内的动态变化.实验用O/Akesu/58毒株以104ID50/mL剂量舌面穿刺接种5头黄牛,出现临床或亚临床症状后痊愈动物会成为可能的FMDV带毒牛.用探杯定期采集实验牛咽喉部黏性液体(O/P液),接种BHK-21细胞增殖病毒后共分离到12株毒株.RT-PCR扩增持续感染分离毒株VP1和3ABC基因,克隆测序发现,所有持续感染分离毒株的VP1基因核苷酸和氨基酸同源性都在98%以上,且没有碱基缺失或插入现象;但与O/Akesu/58的核苷酸同源性仅为85%左右,氨基酸同源性也仅为90%.持续感染分离株VP1基因有多处位点发生突变,其中有16个核苷酸位点发生一致突变,但只有两个位点造成氨基酸突变(I56→T、A210→E);在所有FMDV持续感染分离毒株之间有4个核苷酸位点和3个氨基酸位点发生了颠换.非结构蛋白3ABC基因较为稳定,仅有13个核苷酸位点和5个氨基酸位点的颠换,与宿主嗜性相关的3A基因也没有缺失.推测FMDV持续感染的形成与主要结构抗原基因VP1和宿主嗜性相关基因3ABC变异的关系不显著.     

O型口蹄疫病毒VP1基因的高效可溶表达及抗原性分析

将猪源Ｏ型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)VP1基因克隆到原核表达载体pMBX上，成功地构建重组表达质粒pMBX-VP1。将其转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中，经SDS-PAGE分析，融合蛋白分子量约为58 kD，表达产物占菌体总蛋白的35.5％。 经蛋白可溶性分析，目的蛋白在裂解沉淀中占6.8％，在裂解上清中占31.2％，融合蛋白绝大部分是以可溶形式表达的。经Western blot证实，可溶表达的融合蛋白与FMDV阳性血清具有良好的免疫反应性。将可溶表达的融合蛋白用50%Ni-NTA树脂纯化，用融合蛋白作包被抗原，通过ELISA方法，能特异性地检测出口蹄疫阳性血清。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆与原核表达

以O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)为研究对象，通过RT-PCR扩增到非结构蛋白3ABC基因，定向克隆到原核表达载体pET-42a上。表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测，证明重组载体pET-42a-3ABC成功地在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达了3ABC蛋白，这一研究为建立以基因工程产品为抗原、鉴别诊断自然感染和免疫动物的方法提供了技术条件。