根癌农杆菌介导的环斑病毒外壳蛋白基因转化番木瓜的研究

利用杂种一代番术瓜(cariea papaya L.)实生苗的下胚轴及无菌苗的茎段、叶片等外植体与根癌农杆菌共培养的方法(即改良的叶盘法),将PBIU1质粒上的新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)和环斑病毒外壳蛋白基因(PRSV—CP)导入番木瓜细胞的核基因组中。经共培养的外植体在含有卡那霉素(kan,100μg/ml)的选择培养基上产生抗性的愈伤组织,并通过体胚发生途径再生植株。NPTⅡ分析证明,NPTⅡ基因已在再生植株中稳定地表达。Southern blot分子杂交证明,PRSV—CP基因已整合到番木瓜的核基因组中。本研究已获得转PRSV—CP基因植株,并且在苗床移栽成活。     

水稻叶绿体基因组定点表达载体的构建及增强型绿色荧光蛋白原核表达分析

分别克隆了水稻叶绿体基因组同源重组片段trnI和trnA、具有3种不同核糖体结合位点(RBS)序列的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)、来自烟草叶绿体的16S rRNA基因启动子Prrn和psbA基因终止子TpsbA,将上述元件通过酶切位点依次连接到质粒pUC19上,构建了3种能编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的水稻叶绿体基因组定点整合表达载体pIA - EGFP1、pIA - EGFP2和pIA - EGFP3.进行分子检测验证后,对上述载体进行了大肠杆菌EGFP原核表达检测,结果携带来源于λ噬菌体T7基因10的5′端非翻译区的载体pIA - EGFP3荧光最强,适合用于水稻叶绿体转化.     

胆碱磷酸转移酶基因转化大豆的初步研究

胆碱磷酸转移酶基因(cpt)是磷脂合成代谢途径上一个关键的酶基因,其基因产物是磷脂酰胆碱(PC),PC做为主要膜脂与膜的流动性和植物的抗寒性有密切关系.本实验用花粉管通道法将质粒PRDH401(含35S-35S-AMV-cpt-NOST)导入五个黑龙江常见栽培大豆品种中,对D1代植株进行卡那霉素抗性筛选、低温筛选和PCR检测,初步筛选到转化植株.     

大豆细胞质COXⅡ基因的分离及序列分析

目前关于细胞质雄性不育的机理研究主要集中在植物线粒体上,通过参考大豆线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ(COX Ⅱ)基因序列,合成保守基因引物,从供试材料中克隆到了COXⅡ基因,对基因序列分析表明:该基因编码了一个有280个氨基酸组成的蛋白,推测其可能与大豆细胞质不育有关.     

低温条件下小麦叶绿体基因启动子甲基化的变化

为建立小麦叶绿体基因启动子甲基化的检测体系,检测低温胁迫下小麦叶绿体编码基因甲基化的变化规律并分析叶绿体编码基因表达的调控模式,以低温敏感型小麦返白系及其对照矮变1号为材料,选取4个在低温条件下两个材料间表达有差异的叶绿体基因petN、trnC、petD和rrn16S,通过亚硫酸盐测序法(BSP-seq)分别测定低温处理后这些基因(TaMET1,TaDRM和TaCMT)启动子的甲基化率,并用qPCR的方法对这4个基因以及预测定位于叶绿体的三个DNA甲基转移酶基因进行表达量检测。结果显示,叶绿体基因组总的甲基化水平在低温条件下持续增加,基因间启动子甲基化水平变化并不完全一致,基因型之间也略有差异。4个基因的表达量与甲基化水平的相关性不同,petN的表达对甲基化比较敏感,低温诱导甲基化率增加,基因的表达量则下调,但其余3个基因的表达与甲基化率的变化无直接相关性。返白系中三个DNA甲基转移酶基因的表达在低温条件下都呈上调趋势,但矮变1号中的TaMET1与TaCMT基因表达下调。结果为深入研究低温下小麦叶绿体基因甲基化的变化规律及其对叶绿体基因的调控机理奠定了基础。     

拟南芥AtGPAT9基因cDNA的克隆及其转化大豆的研究

甘油-3-磷酸酰基转移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferases,GPATs;EC 2.3.1.15)是植物种子中储藏性油脂三脂酰甘油(Triacylglycerols,TAGs)合成中的一个关键酶,它催化甘油-3-磷酸分子sn-1位的酰化反应,形成溶血磷酯酸(Lysophosphatidic acid,LPA),从而起动TAGs的生物合成.拟南芥内质网中表达的AtGPAT9在此过程中可能起着重要作用.运用RT-PCR方法克隆到AtGPAT9基因的编码区cDNA,并构建了其植物表达载体,然后通过农杆菌介导的子叶节法对大豆进行了遗传转化,获得抗草丁膦(Phosphinothricin/PPT)筛选剂的再生植株.     

两个组织特异性启动子在转基因棉植株上的表达

棉花农艺性状有效的遗传修饰需要利用启动子来促进转基因在特定植物细胞或某一发育阶段的表达。本研究详细分析了两个组织特异性启动子在转基因棉植株上的表达方式。这两个启动子分别是 :从一个种子蛋白质基因得来的 Gh- sp和从核编码叶绿体基因中得来的 Gh- rbc S。该实验把这两个启动子与一个葡糖苷酸酶 (GUS)报告基因和花椰菜花叶病毒 35S终止子构建在一起并通过农杆菌介导法把这两个基因转到珂字棉 31 2棉花植株上。定性和定量的分析表明 :由 Gh- sp启动子诱导的 GUS基因只是在种子成熟阶段 (约开花 2 5天后 )表达 ;由 Gh- rbc S…     

甘蓝型油菜BnaA06.mTERF1基因的功能及进化分析

在高等植物中,线粒体转录终止因子(mTERF)影响线粒体或叶绿体的基因表达及植物对逆境的反应等生物学过程。为了研究甘蓝型油菜中线粒体转录终止因子1(mTERF1)的功能,本研究以甘蓝型油菜品种中双11号为材料,在A06连锁群上克隆了mTERF1,该基因编码285个氨基酸,含有5个mTERF功能结构域。利用生物信息学分析筛选到37个甘蓝型油菜mTERF家族蛋白,并进行了系统进化树、基因结构及染色体定位分析。此外,构建甘蓝型油菜BnaA06.mTERF1基因的功能互补表达载体,转化拟南芥mTERF1(soldat10)突变体后,拟南芥的表型恢复到野生型(Ler),说明该基因在油菜和拟南芥中具有保守的功能。本研究填补了油菜中线粒体转录终止因子研究的空白,为进一步探究油菜中线粒体转录终止因子的分子功能奠定了基础。     

农杆菌介导的大豆子叶节基因导入和再生植株

以栽培大豆南农７３－９３５，南农８７Ｃ－３９，南农８６－２１，卫５１５子叶节组织为材料，接种农杆菌Ｃ５８Ｃ１（ｐＧＶ２２６０：：ｐＧＶ３００），在含卡那霉素（ｋｍ）２００ｍｇ／ｌ的ＭＳ培养基上仅自卫５１５品种筛选得到５株抗性小植株，对其中最绿的一株进行新霉素磷酸转移酶Ⅱ活性测定。     

大豆γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆与表达分析

采用电子克隆与实验克隆相结合的方法获得了大豆γ-生育酚甲基转移酶基因的cDNA序列,GenBank登录号为AY960126。序列分析结果表明,该cDNA序列含有1个编码350个氨基酸的完整的开放读码框,5′非翻译区具有2个同框终止密码子,3′端具有2个加尾信号和polyA尾巴。启动子区除含有通用核心元件外,还含有许多与光反应有关的作用元件。编码的蛋白质序列含有1个信号肽和γ-生育酚甲基转移酶的特征基序,该蛋白定位于叶绿体中。氨基酸序列比对和系统发育分析结果显示,不同物种之间γ-生育酚甲基转移酶氨基酸序列同源性较高。电子表达分析和RT-PCR组织表达分析结果表明,该基因的表达量与组织中叶绿体含量具有很高的关联,但强光逆境对该基因的表达无影响。     

甘蓝型油菜GPAT6基因启动子的克隆与表达载体构建

通过同源PCR克隆的方法,首次从甘蓝型油菜中克隆了甘油-3-磷酸酰基转移酶6（sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase6,GPAT6）基因长1110bp的启动子,并将其成功构建到植物表达载体pBI121上.重组载体可用于转化拟南芥,探究甘蓝型油菜GPAT6基因的组织表达特征.     

青稞F7-OMT基因的克隆及原核表达分析

类黄酮7-O-甲基转移酶(F7-OMT)具有甲基转移酶功能,能催化底物类黄酮甲基化产生植物抗毒素,提高植物的抗菌性。为了给进一步研究该酶蛋白的功能奠定基础,以青稞"94-19-1"为材料,采用同源克隆方法得到青稞F7-OMT基因编码片段。生物信息学分析表明,青稞F7-OMT开放阅读框(ORF)全长为1173bp,编码390个氨基酸,蛋白分子质量为42 207.8Da,等电点pI为5.36,无信号肽序列,具有甲基转移酶2(Methyltransf_2,pfam00891)和二聚化(Dimerization,pfam08100)保守域。通过亚克隆将F7-OMT连接到表达载体pET-32a上,构建pET-32a-F7-OMT融合表达载体,在E.coli BL21(DE3)pLysS中诱导表达,并采用亲和层析纯化法得到纯化蛋白。     

茶树丙氨酸氨基转移酶基因的克隆与表达分析

丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,Ala AT)是与碳氮代谢相关的一种重要酶类。采用反转录PCR的方法克隆了茶树Cs Ala AT1的c DNA序列,该序列全长1 747 bp,包含一个完整的ORF(1 626 bp),编码541个氨基酸,推导的蛋白质分子量为59.4 k D,理论等电点(p I)为5.82。同源比对结果表明,Cs Ala AT1含有丙氨酸氨基转移酶亚家族保守的辅酶磷酸吡哆醛结合位点,其氨基酸序列与拟南芥At Ala AT1蛋白的相似性为84%。二级结构预测显示该蛋白由α-螺旋(40.67%)、无规则卷曲(29.57%)、β-折叠(13.68%)和延伸链(16.08%)组成,定位于线粒体,不含信号肽与跨膜结构。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测发现Cs Ala AT1在茶树各组织中均有表达,在根中的表达量最高;Cs Ala AT1基因表达对氮素的响应研究表明,成熟叶中Cs Ala AT1受氮素诱导上调表达,高浓度(1 mmol·L-1 NH4NO3)氮素的诱导效应比低浓度(0.1 mmol·L-1 NH4NO3)氮素诱导效应更强烈;在根中,处理24 h后,高氮诱导Cs Ala AT1上调表达,低氮诱导Cs Ala AT1下调表达。     

花生甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆与序列分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的功能及作用机理在模式植物拟南芥中已经得到了较为充分的研究,但是在花生中还没有关于这类基因的报道,其功能也没有得到证实。本研究通过Bioedit软件在花生cDNA文库中找到了6个可能编码GPAT蛋白的基因片段,其中有3个基因没有包含完整的开放阅读框。我们通过5’-和3＇-RACERT—PCR对这3个基因的全长进行了克隆,得到了包含完整读码框的基因序列,并将序列在GenBank上注册,同时对得到的序列进行了初步分析。     

大豆异黄酮和皂甙对大鼠肝癌诱发初期肝脏氧化应激的干预作用

利用Solt-Faber法制备大鼠肝癌初期模型,同时以100 mg.kg-1大豆异黄酮和皂甙干预42 d。然后处死动物,制备肝匀浆及肝线粒体提取液。以比色法测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷酰胺转肽酶(γ-GT)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性及丙二醛(MDA)含量。结果表明,大豆异黄酮和皂甙能降低肝癌发生初期大鼠肝脏ALT、AST、γ-GT和GST活性,升高肝脏及肝线粒体SOD、CAT、GSH-PX活性和降低MDA水平。提示,大豆异黄酮和皂甙具有减轻肝癌发生初期大鼠肝细胞损伤,降低其氧化应激的作用。此作用有助于预防肝癌的发生。     

茶树ACC合成酶基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析

乙烯是一种重要的植物激素,参与植物许多生理过程。ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)合成酶(ACS)是植物乙烯合成过程中的限速酶,对乙烯的合成具有重要的调控作用。利用其它植物ACS基因的保守序列设计兼并引物,采用RACE(Rapid Amplificationc DNA Ends)和RT-PCR等技术,克隆得到编码茶树ACS基因的全长cDNA序列,长1579bp,编码478个氨基酸,预测分子量约为53.7kD,等电点8.039,GenBank登录为EF205149。以Neighbor-Joining法构建进化树,发现茶树ACS基因与柿树中的同类基因亲缘关系最近。茶树ACS基因的克隆为从分子水平认识乙烯在茶树上的生理作用奠定了基础。     

橡胶树5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的克隆及其响应非生物胁迫的表达分析

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)是植物合成芳香族氨基酸的一个重要酶,与许多抗逆相关的次生代谢物的合成有关.本研究利用RACE技术从橡胶树热研7-33-97中获得了全长为2025 bp的HbEPSPS基因cDNA序列,开放阅读框为1572 bp,编码523个氨基酸;使用ProtParam tool预测该基因编码的蛋白质分子量为56.01u,等电点(pI)为7.91.该基因由8个外显子和7个内含子构成,全长4600 bp.实时荧光定量PCR结果表明,HbEPSPS基因在橡胶树叶片、皮、花、胶乳和胚中均表达,其中以叶片中的表达量为最高.激素、干旱、盐和低温等非生物胁迫都能诱导HbEPSPS基因表达量上调,其中茉莉酸甲酯、乙烯和PEG的上调作用最为显著.橡胶树HbEPSPS基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达调控研究将为橡胶树抗逆相关的研究提供理论依据.     

甜菜NADP-ME基因家族的生物信息学分析

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-苹果酸酶(NADP-malic enzyme,NADP-ME)由小基因家族编码,在植物生长发育和应对逆境胁迫中发挥重要作用.为了进一步筛选甜菜NADP-ME基因并分析其功能,本研究对该家族成员进行了详细的生物信息学分析.结果显示,甜菜基因组共有5个NADP-ME基因,基因长度介于6537 bp...     

5种蔷薇科树种多酚氧化酶比较基因组学分析

蔷薇科植物中有多种具有重要价值的水果,如苹果、梨、桃、草莓和黑树莓等。这些水果普遍容易发生由多酚氧化酶(PPO)介导的酶促褐变而导致重大经济损失,从全基因组角度分析比较PPO基因家族,有助于加深对PPO基因家族和功能的认识。采用比较基因组学的方法,对这5种植物的PPO基因家族进行了基因鉴定、染色体定位、编码蛋白的亚细胞定位、内含子统计分析、基因系统进化、基因倍增与丢失等特征分析。从这5种植物中,共计鉴定出了42个PPO基因,其中6个基因被认定是假基因;绝大多数基因编码的蛋白定位于叶绿体,2个定位于线粒体,3个是分泌型蛋白;PPO基因在染色体上有串联重复和散布两种形式;9个基因具有内含子,聚类结果显示可以将它们分为6个类型,每个基因类型在进化过程中都发生过基因倍增和丢失;同型基因内含子的位置和大小具有相似性。这些结果揭示蔷薇科植物PPO基因内含子是伴随着基因倍增产生的,基因倍增也是推动PPO基因多样化的重要动力,PPO基因倍增和丢失差异导致PPO基因数量在不同物种之间产生差异。     

花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因AhLEAL的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

低温、高盐和干旱等非生物胁迫严重影响花生的生长和产量,而花生中有关非生物胁迫的研究及抗性基因的挖掘较少。胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是一类亲水性蛋白,其功能主要是参与调控植物应答脱水相关的非生物胁迫包括耐盐、抗旱和抗冻等。本研究以花生品种花育33号为试验材料,根据cDNA文库中已知的胚胎发育晚期丰富蛋白基因全长序列设计引物,通过RT-PCR克隆到该基因。该基因全长为555bp,开放阅读框为291bp,编码97个氨基酸。核苷酸序列比对表明,该基因与花生中已注册基因AhARG2(XM_016113504)同源性为100%,与AhLEA6-1(HM543588)同源性为99%。蛋白序列比对分析表明,该基因编码的蛋白与Genbank上已经注册的沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)、牧豆树(Prosopis juliflora)和柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)等植物中的胚胎发育晚期丰富蛋白同源性达到近65%。我们将该基因命名为AhLEAL(Arachis hypogaea Late Embryogenesis Abundant Like)。预测该基因编码的蛋白可能定位于细胞液、线粒体、内质网和叶绿体中。荧光定量PCR结果显示,AhLEAL在花生叶片和根中的表达受低温和高盐胁迫的强烈诱导,在根中受干旱胁迫的强烈诱导,说明该基因可能参与了花生对三种非生物胁迫的适应性调控;此外,AhLEAL在花生叶片和根中的表达也明显受ABA的诱导,说明该基因对花生逆境胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式进行的。