基质中添加西兰花残体对大丽轮枝菌GFP标记菌株在棉花体内扩展的影响

 由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病是一种难以防治的土传病害,西兰花残体还对其有一定的防治作用,防效为62.82%。为解析西兰花残体对棉花黄萎病的防治机制,本研究通过土壤杆菌转化的方法构建了大丽轮枝菌的绿色荧光标记菌株,采用共聚焦显微镜观察标记菌株在添加西兰花残体营养基质中和空白对照营养基质种植的棉花体内的侵染和扩展情况。结果表明构建的标记菌株gfp-wx-1与野生菌株wx-1的生物学特性无显著性差异。同时发现大丽轮枝菌在添加西兰花残体营养基质中棉花体内扩展较慢,具体表现为:在空白营养基质种植的棉花体内,大丽轮枝菌在接种第2 d时就可侵染根尖表层及根内部,第3 d到达茎部维管束,第5 d叶片可观察到少量病原菌,第7 d第一片子叶呈现大量病原菌,后期迅速扩展,叶片出现黄萎病斑;而在营养基质中添加西兰花残体种植的棉花体内,大丽轮枝菌在接种第2 d时就可侵染根尖表层,第3 d侵染根尖内部,第5 d侵染茎部维管束,直到第7 d第一片子叶才出现少量病原菌,后期扩展慢,叶片病斑较少。本研究通过荧光定量PCR方法检测了大丽轮枝菌在两个处理棉花根部定殖情况,结果表明西兰花残体能够显著降低大丽轮枝菌在棉花根部定殖的量。该研究初步明确了西兰花残体对棉花黄萎病的防治机制,为棉花黄萎病的绿色防治提供了一条新的途径。     

大丽轮枝菌侵染抗感棉种的组织学过程观察

 棉花黄萎病是一种极难防治的土传性真菌病害,研究病原菌侵染棉花的组织学过程对致病机理解析和抗病资源利用具有重要意义。本研究利用绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌系统研究了其对抗病棉种海岛棉7124和三裂棉、感病棉种军棉1号和戴维逊棉的侵染过程。结果表明,大丽轮枝菌对抗/感棉种的初始侵染没有明显差异,接菌5 h后,分生孢子均能吸附在感病和抗病棉种的根表面。但侵染过程存在显著差异,侵染感病棉种中病原菌3~5 d到达皮层,5~7 d达到维管束,随后迅速扩展繁殖,侵染14 d后即完成系统侵染,并开始产生黄萎病症状;而病原菌侵染抗病棉种,5~7 d才侵入皮层,7~10 d到达维管束,14 d后仍无法扩展,病原菌的定殖与发展受到限制,无法形成系统侵染,较少形成黄萎病症状。本研究通过绿色荧光蛋白标记大丽轮枝菌对抗/感棉种的侵染过程研究,为大丽轮枝菌致病机理研究和抗性资源利用提供了强有力的理论依据。     

棉秆生物炭对大丽轮枝菌生长及毒素作用的影响

棉花黄萎病难以防治的根源在于大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb在土壤中形成的微菌核能抵抗不良环境,并在土壤中长期存活,将棉秆加工成生物炭施入棉田,可克服棉秆直接还田的缺点,从源头上防止黄萎病菌进入土壤。为探索棉秆生物炭还田对棉花黄萎病原菌的影响机理,采用液态摇床培养及平皿固态培养法研究生物炭对大丽轮枝菌菌丝生长及微菌核萌发的影响;通过平皿内棉花和甜瓜种子发芽试验研究生物炭对大丽轮枝菌毒素的减毒作用。结果表明:液态培养条件下,棉秆生物炭对大丽轮枝菌菌丝生长抑制作用不明显,在固态培养下对菌丝体生长有一定促进作用;生物炭能减慢微菌核的萌发速率,但对最终萌发率无影响;液态培养中加入棉秆生物碳对大丽轮枝菌毒素有较强的减毒作用。在摇床培养中期,加入2.0 g·L-1生物炭处理与对照棉种在培养12天时的发芽率分别为53.3%与33.3%(P0.05);前期、中期及后期加入0.5 g·L-1生物炭处理的棉花幼苗总长度分别为对照的4.9、2.1倍及3.2倍;加入棉秆生物碳处理甜瓜种子发芽率、胚根长度、胚轴长度及总苗长较对照均有不同程度增加。表明棉杆生物炭对棉花黄萎病菌大丽轮枝菌菌丝生长、微菌核萌发的抑制作用较弱,对大丽轮枝菌毒素危害有较强的减毒作用。     

大丽轮枝菌蛋白激发子PevD1诱导棉花抗病性及作用机理

 PevD1是一种大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)分泌蛋白,具有激发烟草过敏反应(HR)和系统获得性抗病(SAR)的功能。为明确蛋白PevD1诱导棉花抗病性及其作用机制,本文利用大肠杆菌表达、纯化的PevD1诱导棉苗植株,检测棉苗对大丽轮枝菌的抗性及免疫应答反应。结果表明,大肠杆菌表达的PevD1重组蛋白不是棉花品种“新陆早42号”的致萎因子,叶片注射8 μg/mL PevD1蛋白诱导3 d后根部接种大丽轮枝菌,15 d后PevD1处理组病害减轻率达35.04%。PevD1能诱导棉花叶片抗性早期信号分子H₂O₂产生和NO积累,维管束细胞壁加厚、木质素和酚类物质的积累。另外,PevD1处理能提高防御酶PAL、POD和PPO活性,提高棉花抗性基因和木质素合成相关基因PAL、C4H1、4CL的转录水平。说明PevD1通过激发棉花免疫系统而提高抗病性,该研究不仅为利用PevD1蛋白激发子控制棉花黄萎病提供了科学依据,同时也为阐明棉花与大丽轮枝菌互作机理提供了理论基础。     

棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌的快速分子检测

大丽轮枝菌Verticillium dahliae是引起棉花黄萎病的土传病害病原真菌。快速及时地检测出大丽轮枝菌,对棉花黄萎病的早期预警及后期防治具有重要意义。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术对已报道大丽轮枝菌的检测引物进行验证、筛选和改进,获得1对改进的特异性PCR引物VDS-F/VDS-R。在优化的反应体系与扩增条件下,能特异性地从大丽轮枝菌基因组扩增出l条约520 bp的产物条带,检测灵敏度达到10~(-2)ng/μL;利用该引物可特异性地从含有大丽轮枝菌的土壤及棉花植株组织中检测出病原菌;采用巢氏PCR法对人工病土的检测灵敏度达到了10个孢子/g土。表明本引物的PCR检测体系可用于棉花黄萎病的早期快速检测。     

利用GFP荧光标记比较大丽轮枝菌对抗/感马铃薯品种的侵染过程

为了对马铃薯黄萎病菌的系统侵染进行研究,本研究首先建立了用于观察大丽轮枝菌侵染马铃薯过程的培养皿滤纸体系,在此基础上利用带有GFP标记的大丽轮枝菌对不同抗性水平马铃薯根系侵染过程进行了比较研究,结果表明：马铃薯根系在浓度为10⁷个·mL^-1的大丽轮枝菌分生孢子液中浸泡处理2 h后,分生孢子可附着在抗/感马铃薯根系的根毛上,单个视野中感病品种根系上分生孢子附着平均数量为65个,显著高于抗病品种根系上附着的分生孢子数量(23个);接种12 hpi,根系上附着的分生孢子开始萌发,但抗/感品种根系表面孢子的萌发率无显著差异;接种3 dpi后,菌丝体能够突破根系表皮,进入细胞间隙,但感病品种根系中菌丝的扩展速度更快,并在7 d后到达根系的维管束内部;而抗病品种则在接种9 dpi,在维管束内才能够观察到绿色荧光信号;接种10 dpi,感病品种根系中可见新的分生孢子梗和分生孢子形成,而抗病品种中未见有分生孢子的形成。接种30 dpi,感病品种地上部茎杆中定殖的病原菌量是抗病品种的5倍以上;同时,感病品种叶柄中的病原菌数量也显著高于抗病品种。     

大丽轮枝菌在茄田土壤中的分布及抽样方法

对茄子黄萎病在田间的空间分布及取样方法进行了研究,并探讨了田间土壤带菌量的准确测定方法。研究结果表明:用分布型指数法测定茄田土壤中微菌核的空间分布型,当菌核数量在8-63 ～39-93 个/g 干土范围内,为聚集分布。当茄田发病率小于75 % 时,病株在田间均属聚集分布;发病率大于75 % 时呈均匀分布。土壤中微菌核的调查方法以棋盘式为最适宜。     

大丽轮枝菌在茄田土壤中的分布及抽样方法

对茄子黄萎病在田间的空间分布及取样方法进行了研究,并探讨了田间土壤带菌量的准确测定方法。研究结果表明:用分布型指数法测定茄田土壤中微菌核的空间分布型,当菌核数量在8-63 ～39-93 个/g 干土范围内,为聚集分布。当茄田发病率小于75 % 时,病株在田间均属聚集分布;发病率大于75 % 时呈均匀分布。土壤中微菌核的调查方法以棋盘式为最适宜。     

绿色荧光蛋白基因标记棉花黄萎病菌

以携带有潮霉素抗性筛选标记的pCTHyg载体为骨架,构建了含有增强型绿色荧光蛋白基因sGFP的载体pCH-sGFP,并通过农杆菌介导的遗传转化法导入引起棉花黄萎病的高致病力大丽轮枝菌Vd991,获得了sGFP整合到大丽轮枝菌基因组的转化株。通过转化子荧光信号、生长表型和致病力筛选鉴定,获得了1株与Vd991生长和致病力无显著差异且荧光信号强烈的转化株Vd gfp77。侵染棉花根部试验表明,Vd-gfp77侵染棉花后快速扩展繁殖,子代仍然能发出强烈的荧光信号。本试验绿色荧光蛋白标记大丽轮枝菌的成功构建,为后续大丽轮枝菌侵染棉花过程的组织学和致病机理研究提供了良好的研究材料。     

桃树黄萎病在我国首次发生报道

在甘肃省农业科学院林果所2010年建植的桃园内,自2011年以来,每年6-8月都陆续出现枯死的桃树;严重年份桃树病株率达20%。经病原菌分离培养、形态观察和致病性测定,确认桃树枯死是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染所致。这是桃树黄萎病在我国的首次发生报道。     

喷施外源激素对棉株棉花黄萎病发病程度的影响

通过温室人工接菌 ,研究了喷施 4种外源激素 3-吲哚乙酸、赤霉素、脱落酸和反 -玉米素对棉苗棉花黄萎病发病程度的影响。结果表明赤霉素在5.0～80.0μg/ml浓度范围内 ,提高了棉苗抗病性 ,但棉苗表现徒长、叶片畸形 ;反 -玉米素25.0～80.0μg/ml明显促进了病情发展 ;3-吲哚乙酸10μg/ml,脱落酸0.5μg/ml,反 -玉米素10 μg/ml的处理对降低棉苗的发病率和发病程度作用较明显。     

北疆棉花黄萎病发病率调查及土壤中黄萎病菌微菌核数量与种群类型分析

为了解北疆棉花黄萎病的发生情况及发病与土壤中黄萎病菌微菌核数量的关系和病原菌种群类型, 2021年对北疆石河子?奎屯?博乐等8市(县)棉田棉花黄萎病发病率?土壤中黄萎病菌的微菌核数量?菌株种群类型进行了抽样调查?结果表明, 北疆未发生棉花黄萎病的棉田占49.2%, 0%<发病率<5.0%的棉田占32.7%, 发病率≥5.0%的棉田占18%?与2013年?2015年相比, 2021年无病田率分别增加17.7和12.7百分点, 发病率≥5%的棉田分别减少15.7和21.6百分点?从棉田黄萎病发病率与土壤中微菌核数量的关系来看, 整体上北疆棉田棉花黄萎病发病率与微菌核数量相关性不显著(r=0.119 1); 分区域看, 石河子-沙湾片区?奎屯-乌苏片区?精河-博乐片区棉田黄萎病发病率与微菌核数量的相关系数分别为0.033 2?0.007 6?0.062 3, 均无显著相关性; 而呼图壁-玛纳斯片区棉田黄萎病发病率与微菌核数量的相关系数为0.635 7, 呈中度正相关?土壤中的黄萎病菌菌株以菌核型为主, 占57.9%, 菌丝型占23.2%, 中间型占18.9%?用特异性引物进行PCR检测表明, 土壤中黄萎病菌落叶型菌株占97.6%, 占绝对优势?本研究将为北疆棉区棉花黄萎病的综合防控提供理论依据?     

韭菜等几种植物根系分泌物对棉花黄萎病菌的影响

通过水培法收集韭菜、大葱、野薄荷、藿香和薰衣草的根系分泌物,研究其对大丽轮枝菌菌丝生长、孢子萌发的影响,并通过室内盆栽试验研究了植物根系分泌物对大丽轮枝菌微菌核萌发的影响。结果表明,5种植物根系分泌物对大丽轮枝菌菌丝生长和孢子萌发均表现为抑制作用;随着浓度的升高,抑制作用增强,而在同一浓度下,随着处理时间的延长,根系分泌物对孢子萌发的抑制作用逐渐减弱。盆栽试验表明,植物根系分泌物对大丽轮枝菌微菌核的萌发均表现为抑制作用,且微菌核对韭菜根系分泌物最为敏感。5种植物中,韭菜根系分泌物的抑制作用最强,野薄荷次之,藿香最弱。     

棉花抗黄萎病品种选育方法探讨

 在棉花抗病育种中,通过病圃或重病地选择抗病单株是常规的选育方法,但其在抗黄萎病育种中的效果并不理想。如何提高抗黄萎病育种效率,促进育种进程是目前急需解决的问题之一。为此,19982002年我们在北京人工病圃,对不同抗病杂交组合和选育方法的选育效果进行了研究。结果表明,在双亲本均为抗(耐)品种的杂交后代群体中,以9月中旬是抗病还是感病并没有多少关联,对黄萎病抗性的选育应选群体抗病性强的株系或组合,以其丰产性为主要选育目标;只有抗与抗(或高耐)的组合中才能选出黄萎病抗性更高的株系;在抗(耐)品种中,后期无论是抗或感的单株其后代的抗病性差异不明显     

应用聚合酶链式反应鉴定新疆棉花落叶型黄萎病菌

用一对棉花落叶型黄萎病菌的特异性引物D1和D2进行PCR扩增,对于落叶型黄萎病菌,该对引物可特异性地扩增产生一段550bp的产物,而非落叶型黄萎病菌则不能被扩增.供试的35个新疆黄萎菌系中,有3个菌系扩增出550bp大小的落叶型黄萎病菌特异性片段,表明目前新疆已存在落叶型黄萎病菌,用此技术可快速、准确地检疫和鉴定落叶型黄萎病菌.     

Effects of Verticillium dahliae on tomato root morphology considering plant growth response and defence

The soilborne pathogen Verticillium dahliae invades its host via the root, and spreads systemically throughout the plant. Although a functional root system of appropriate size is essential for water and nutrient uptake, to date, effects of pathogens on root morphology have not been frequently investigated. Therefore, this study aims to improve knowledge of how V. dahliae infection impairs root morphological characteristics of tomato, considering plant growth and physiological responses, particularly those involved in defence in roots and leaves over a growing period of up to 28 days post‐inoculation. Verticillium dahliae infection suppressed the growth of both shoot and root. Diseased plants developed a smaller leaf area, and exhibited a reduction in the rate of photosynthesis and stomatal conductance. An early response to pathogen invasion in the host root was the up‐regulation of several defence‐related genes, such as proteinase inhibitor II (Pin2), β‐1,3‐glucanase A (GluA) and two pathogenesis‐related genes (PR‐1a, PR‐1b). However, this response did not prevent colonization of the roots by the pathogen. Although a high variability in pathogen density was found within the root system, a significant increase of both the specific root length and surface area was observed in response to pathogen invasion; these traits correlated with water use efficiency. Morphological changes of the root may represent an adaptive response evolved to sustain the supply of both water and nutrients in the presence of the pathogen.     

陆地棉对黄萎病抗性的分子标记研究

 利用陆地棉标准系TM-1和常抗棉2个陆地棉品种杂交并自交,获得109个F₂单株及F_2:3家系为作图群体,以SSR、RAPD和SRAP 3种分子标记进行抗黄萎病性状的分子标记筛选。结果从1611对(条)引物中仅筛选到70对(条)多态性引物,获得75个多态性位点并进行标记间的连锁性分析。75个标记构建了一个包括15个连锁群,全长535 cM的陆地棉品种间分子标记遗传连锁图,标记间平均距离为11.15 cM,有27个标记不能进入任何连锁群。连锁群的标记数最少2个,最多6个;长度从1.0 cM到92.7 cM不等。对其F_2:3家系的成株期抗黄萎病性状即平均病情指数的分布进行分析,显示其呈正态分布,进一步说明陆地棉对黄萎病的抗性为数量遗传;单标记分析及复合区间作图,检测出与抗黄萎病性相关的3个QTL,分别位于第3、5、6连锁群上,贡献率分别为14.15%、3.45%和18.78%。另外,对该群体生长过程中黄萎病不同发病高峰期的病情也进行了分析。