‘阳光玫瑰’葡萄病毒小RNA测序鉴定及RT-PCR检测

 ‘阳光玫瑰’是我国从日本引进的葡萄优良品种。为了明确我国‘阳光玫瑰’葡萄病毒病的病原,本研究采用小RNA测序技术对2株显症和无症状的‘阳光玫瑰’葡萄样品进行病毒鉴定结果显示:显症样品中测定到8种病毒,其中包含葡萄蚕豆萎蔫病毒(Grapevine fabavirus, GFabV)和灰比诺葡萄病毒(Grapevine Pinot gris virus, GPGV);无症状样品中测定到3种葡萄病毒。对46个‘阳光玫瑰’样品进行14种葡萄病毒的RT-PCR检测,结果表明:‘阳光玫瑰’葡萄带毒率较高,病毒复合侵染情况普遍;显症样品中,GFabV检出率为88.2%,GPGV和葡萄浆果内坏死病毒(Grapevine berry inner necrosis virus,GINV)检出率为64.7%和29.4%,均明显高于无症状样品(13.8%和10.3%)。本研究旨在探明‘阳光玫瑰’葡萄携带病毒的种类和侵染状况,为其病毒病防控及病毒脱除奠定基础。     

吉林、黑龙江毛葱病毒病调查

本研究为明确吉林和黑龙江省毛葱病毒病发生率,从两省5个地区共采集255份毛葱样品。根据毛葱4种主要病毒基因组序列设计特异性引物,对胡葱黄条病毒Shallot yellow stripe virus(SYSV)和青葱X病毒Shallot virus X (SVX)、洋葱黄矮病毒Onion yellow dwarf virus (OYDV)和葱潜隐病毒Shallot latent virus (SLV)进行双重RT-PCR检测。结果表明,229份样品检出病毒,带毒率为89.8%,SLV的检出率最高,达87.06%,OYDV次之,为36.86%,SYSV检出率偏低,为0.78%;同时存在病毒复合侵染,其中双病毒复合侵染为SLV和OYDV,检出率为33.3%;三病毒复合侵染为SYSV、OYDV和SLV,检出率为0.78%,未发现4种病毒复合侵染。本研究为吉林和黑龙江种植区毛葱病毒病防治提供了参考依据。     

葡萄灰皮诺病毒微滴数字RT-PCR检测方法的建立

正葡萄灰皮诺病毒(Grapevine Pinot gris virus,GPGV)最早于2012年由意大利研究人员利用高通量测序技术发现(Giampetruzzi et al.,2012),该病毒可引起葡萄叶片褪绿、斑驳、皱缩、变形等症状,导致葡萄植株发育不良、成熟期延迟、产量降低、果实腐烂,还可与其它病毒共同作用产生复合负面效应。目前,葡萄灰皮诺病毒病尚缺乏有效防治药剂,为防控该病毒病的发生和传播,本研究拟设计特异性引物     

葡萄蚕豆萎蔫病毒中国分离物基因组全长序列分析

 葡萄蚕豆萎蔫病毒(grapevine fabavirus,GFabV)是近年报道的葡萄新病毒,与葡萄褪绿斑驳、皱缩等症状发生相关,严重影响葡萄长势。本研究采用小RNA测序结合Sanger测序方法分别对表现褪绿斑驳的‘贝达’和无症状的‘赤霞珠’葡萄中的GFabV分离物进行基因组全长序列测定,获得了GFabV分离物LN_BETA2和LN_CXZ的基因组全长序列,其RNA1基因组全长分别为5 824 bp和5 823 bp,RNA2基因组全长分别为3 132 bp和3 135 bp。LN_BETA2与LN_CXZ的RNA1编码的多聚蛋白核苷酸序列之间的同源性为81.7%,与其他GFabV分离物多聚蛋白核苷酸同源性分别为73.4%~99.5%和73.5%~82.5%;LN_BETA2和LN_CXZ的RNA2编码的多聚蛋白核苷酸同源性为83.8%,与其他GFabV分离物多聚蛋白核苷酸同源性为75.0%~83.3%和68.2%~98.6%。系统进化树分析结果显示,在RNA1基因组中,LN_BETA2划分在组3,LN_CXZ形成单独的分支。RNA2基因组中,LN_BETA2和LN_CXZ分别划分在组3和组5中。本研究首次报道了GFabV中国分离物基因组全长序列,可为今后GFabV生物学特性及致病性研究提供工作基础。     

‘阳光玫瑰’葡萄中主要葡萄病毒病原的检测

正葡萄病毒病可以造成葡萄植株长势衰退、产量降低,甚至死亡。对葡萄上发生的病毒种类和侵染情况进行研究,可为我国葡萄病毒病防控策略的制定提供科学依据。‘阳光玫瑰’(Shine Muscat)葡萄是日本国家果树科学研究所选育的新品种(Yamada et al.,2008),引入我国后在各地栽培过程中普遍表现出叶片反卷、畸形、褪绿斑驳、透明斑等类似病毒病的症状,严重影响果实产量和品质,目前尚无关于     

基于DPO引物的SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR检测葡萄卷叶伴随病毒3号

正葡萄卷叶病是葡萄上一种重要的病毒病,在国内分布较为普遍,引起该病的葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaV)是由多种病毒单独或复合侵染造成。已报道的GLRaVs至少有5种,其中GLRaV-3是葡萄卷叶病毒属Ampleovirus典型成员(Ling et al.,2004)。目前,检测GLRaV-3的方法主要有指示植物法、酶联免疫吸附法、     

新疆三种葡萄病毒RT-PCR检测及序列分析

为研究新疆葡萄中沙地葡萄茎痘伴随病毒(Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPa V)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFk V)及葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)的发生情况和新疆分离株系统进化关系,分别克隆3种病毒新疆分离株部分基因区域,应用RT-PCR对新疆64份葡萄样品中上述3种病毒进行检测,并进行系统进化分析。结果显示,GRSPa V、GFk V和GVA的检出率分别为31.3%、62.5%和25.0%。新疆GRSPa V分离株(KJ801847)与美国GRSPa V分离株(AY368590)同源性达96.59%;新疆GFk V分离株(KJ801846)与日本GFk V分离株(AB222861)及中国辽宁GFk V分离株(JF927942)的同源性分别为91.70%和91.03%;新疆GVA分离株(KJ801845)与波兰GVA分离株(JN860997)同源性为93.88%,与中国四川GVA分离株(HQ671655)及辽宁GVA分离株(FJ445220)的同源性分别为92.92%和89.53%。表明3种葡萄病毒在新疆发生比较普遍,且新疆分离株与国内其它地方的分离株存在较大差异。     

广西局地西番莲病毒病的病原鉴定及优势病毒分析

 在广西采集表现斑驳、花叶症状疑似病毒病的西番莲叶片样品,利用小RNA测序技术,结合生物信息学分析,鉴定侵染西番莲的病毒种类。参考测序结果采用DAS-ELISA和RT-PCR方法对2015~2018年间采集的385份疑似病毒病样品进行检测,分析引发广西西番莲病毒病的优势病毒种类。结果显示:小RNA共获得20 921 061 clean reads,拼接获得560个contigs,其中99个contigs被注释为夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus,TeMV),97个contigs被注释为黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV),69个contigs被注释为东亚西番莲病毒(East Asian passiflora virus,EAPV),12个contigs被注释为大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)。提取送测序的同批样品叶片的总RNA进行RT-PCR验证,可检测出TeMV、EAPV和CMV 3种病毒,未检出SMV。采用DAS-ELISA和RT-PCR对采集的样品进行检测,结果发现284份样品为阳性样品,检出率为73.76%,其中TeMV的检出率最高为64.16%,其次为EAPV和CMV,检出率分别为41.30%和11.43%;3种病毒存在复合侵染现象,其中TeMV+EAPV的检出率最高为24.94%,TeMV+CMV的检出率为4.16%,EAPV+CMV的检出率为0.26%,3种病毒复合侵染的检出率为4.94%。     

福建省福清地区马铃薯病毒病病原的分子检测

2017年调查福建福清地区马铃薯病毒病的发生情况,以明确该地区马铃薯主要病毒病原。共采集了46份疑似感染病毒的马铃薯植株,提取总RNA,利用RT-PCR技术进行分子检测,结果表明,福清地区危害马铃薯的病毒有马铃薯Y病毒Potato virus Y(PVY)、马铃薯卷叶病毒Potato leaf roll virus(PLRV)、马铃薯S病毒Potato virus S(PVS),检出率分别为56.52%、17.39%和10.87%,以PVY检出率最高,说明PVY是危害该地区马铃薯样品的主要病毒病原。通过病毒复合侵染进行分析,发现该地区存在病毒复合侵染马铃薯现象。研究结果可为福清地区马铃薯种薯的引进和病毒病害防治提供参考依据。     

从葎草中检出复合侵染的多种病毒

采用抗原直接包被酶联免疫吸附测定法（ELISA）对采自重庆近郊的34个葎草样品进行了主要病毒种类的检测。其中马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)的侵染最普遍,其阳性检出率达44.12%;马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)的阳性检出率最低,仅为26.47%,其余5种病毒,烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus, ToMV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)及蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2, BBWV-2)的阳性检出率均为35.29%。葎草样品受多种病毒的复合侵染现象非常严重,15个阳性样品中病毒复合侵染率为80%,其中75%的样品检测到7种病毒复合侵染。     

云南三七病毒病的发生及病毒种类检测

 对云南省文山市、昆明市、红河州、曲靖市的三七主要种植区进行病毒病调查及相关病毒检测,发现病毒病在上述地区均有发生,年平均发病率均在5%以上,且种植年限越长发病率越高,已成为三七上仅次于根腐病的主要病害。三七病毒病症状类型复杂多样,主要有白化、黄化、褪绿、斑驳、皱缩、卷叶和坏死等。利用PCR/RT-PCR对2011年~2015年,以及2017年采集的466份疑似病毒病样品进行检测,发现侵染三七的病毒主要有三七Y病毒(Panax virus Y,PnVY)、中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)及其卫星(tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB)、三七A病毒(Panax notoginseng virus A,PnVA)和烟草扭脉病毒(tobacco vein distorting virus,TVDV),基中PnVY为当前为害云南三七的优势病毒,TVDV在三七上侵染为害系黄症病毒科成员侵染人参属植物的首次报道。PnVY、TYLCCNV、PnVA和TVDV的平均检出率分别为51.5%、31.9%、10.7%和7.0%,存在PnVY + TYLCCNV、PnVY + PnVA以及PnVA + TVDV复合侵染的现象,复合侵染的检出率分别为20.6%、3.4%和0.3%。未检测到番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt tospovirus,TSWV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒、毛形病毒属(Crinivirus)病毒,以及菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)中除TYLCCNV以外的其他病毒。     

云南三七病毒病的发生及病毒种类检测

 对云南省文山市、昆明市、红河州、曲靖市的三七主要种植区进行病毒病调查及相关病毒检测,发现病毒病在上述地区均有发生,年平均发病率均在5%以上,且种植年限越长发病率越高,已成为三七上仅次于根腐病的主要病害。三七病毒病症状类型复杂多样,主要有白化、黄化、褪绿、斑驳、皱缩、卷叶和坏死等。利用PCR/RT-PCR对2011年~2015年,以及2017年采集的466份疑似病毒病样品进行检测,发现侵染三七的病毒主要有三七Y病毒(Panax virus Y,PnVY)、中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)及其卫星(tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB)、三七A病毒(Panax notoginseng virus A,PnVA)和烟草扭脉病毒(tobacco vein distorting virus,TVDV),基中PnVY为当前为害云南三七的优势病毒,TVDV在三七上侵染为害系黄症病毒科成员侵染人参属植物的首次报道。PnVY、TYLCCNV、PnVA和TVDV的平均检出率分别为51.5%、31.9%、10.7%和7.0%,存在PnVY + TYLCCNV、PnVY + PnVA以及PnVA + TVDV复合侵染的现象,复合侵染的检出率分别为20.6%、3.4%和0.3%。未检测到番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt tospovirus,TSWV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒、毛形病毒属(Crinivirus)病毒,以及菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)中除TYLCCNV以外的其他病毒。     

葡萄病毒E分子检测及基因序列分析

 皱木复合病(rugose wood complex disease)是一种发生普遍、危害严重的葡萄病毒病,该病与葡萄病毒属(Vitivirus)病毒的侵染密切相关,葡萄病毒E(Grapevine virus E,GVE)是葡萄病毒属的新成员。为明确我国GVE侵染状况以及不同分离物的基因变异情况,本研究针对GVE的MP和CP基因设计了两对引物,RT-PCR结果表明,两对引物均能从带毒样品中扩增到目的基因片段。采用上述引物检测了211株葡萄样品,GVE检出率为5.7%。对7个GVE分离物的外壳蛋白基因进行测序和系统进化树分析,结果显示,上述分离物克隆分别处于2个明显分化的组群(Group I 和Group II)。研究测定了GVE中国分离物GFMG-1的全基因组序列,该分离物与日本分离物TvAQ7核苷酸序列相似度高达98%,但与日本分离物TvP15、南非分离物SA94、美国分离物WAHH2及波兰分离物59PE核苷酸序列相似性仅为70%~75%。本研究为进一步明确我国GVE发生、分布及分子检测提供了依据。     

我国灰比诺葡萄病毒分离物检测及基因序列分析

 灰比诺葡萄病毒(Grapevine Pinot gris virus, GPGV)是国内新近报道的葡萄病毒,能引起葡萄叶片褪绿斑驳、皱缩及变形等症状,严重影响葡萄长势。为明确我国GPGV的发生及基因序列变异情况,本研究采用RT-PCR方法对采自我国15个省(市)自治区的195个葡萄样品进行检测,其中55个葡萄样品检测出GPGV。对49个GPGV阳性分离物的外壳蛋白(coat protein, cp)和运动蛋白(movement protein, mp)基因进行克隆、测序, 序列分析结果显示:来源于国内外的GPGV分离物cp基因和mp基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为85.30%~100%和95.00%~100%、85.73%~99.87%和95.58%~100%。基于cp和mp基因序列构建的进化树,将GPGV分离物划分为3个明显的组群。其中,大部分GPGV分离物被划分在组群1内,其它中国GPGV分离物形成2个新的组群2和3。本研究是关于中国GPGV分离物基因序列变异的初次报道,可为进一步开展GPGV分子检测的技术研发及不同变种的致病性研究提供依据。     

葡萄卷叶伴随病毒2实时荧光定量RT-PCR技术的检测应用

通过引物筛选和体系优化建立了葡萄卷叶伴随病毒2 Grapevine leafroll-associated virus 2(GLRaV-2)的SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量RT-PCR检测技术。该技术标准曲线扩增效率为102.2%,决定系数为0.999,最低检出限可达10-3稀释梯度,是常规RT-PCR的100倍。对不同季节和不同部位葡萄样品的检出率普遍高于常规RT-PCR。春夏秋季样品检出率分别为67%、89%和86%,比常规RT-PCR检出率分别高42%、28%和17%。冬季休眠枝条检出率最高(100%),与常规RT-PCR相同。夏季老叶柄和卷须、秋季和冬季枝条等样品检测效果最好,检出率均为100%。对来自我国17个省38个品种的116份田间葡萄样品检测结果表明,qRT-PCR共检测到10个样品为阳性,检出率略高于常规RT-PCR。     

基于小RNA深度测序技术鉴定侵染我国部分省市草莓种苗的病毒种类

随着草莓保护地栽培面积的增加和无性繁殖种苗的繁殖与调运,草莓病毒病的发生与流行日益严重。为明确侵染我国部分省市草莓种苗的病毒种类,应用小RNA深度测序技术进行检测,并利用RT-PCR技术对结果进行验证及序列分析。结果表明,从来自我国7省市的41株具有典型病毒病症状的草莓种苗样品中检测到草莓斑驳病毒strawberry mottle virus (SMoV)、草莓镶脉病毒strawberry vein banding virus(SVBV)和草莓轻型黄边病毒strawberry mild yellow edge virus (SMYEV)3种。SMoV、SVBV和SMYEV的检出率分别为34.1%、24.4%和2.4%。选取不同产地草莓种苗上检出的不同病毒进行部分序列测定和分析,获得了3个SMoV分离物(四川分离物schhy13、辽宁分离物lnhy23和河北分离物hbhy28)的部分RNA1 3′端非编码区606 bp核苷酸序列,其一致性为98.12%～99.34%。测定并获得了5个SVBV分离物(辽宁分离物lnhy15、lnhy17、lnhy24、河北分离物hbhy28和陕西分离物sh...     

河南甜樱桃病毒病害调查及病原检测

在河南省郑州市、巩义市、荥阳市、新郑市选择具有代表性的甜樱桃生产园对病毒病发生情况进行调查,采集表现为疑似病毒病症状的样本65份,利用7种病毒引物进行RT-PCR检测。5种病毒检测结果呈阳性,分别是李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)、樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus,CGRMV)、樱桃坏死锈斑病毒(Cherry necrotic rusty mottle virus,CNRMV)及樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA);序列分析结果表明,5种病毒扩增片段与GenBank中注册的相应病毒核苷酸序列均具有较高的一致性;样本病毒检出率为100%,其中13份样本为单独侵染,其余52份样本均为多病毒复合侵染,占比高达80%,复合侵染比例随着侵染病毒种类的增多逐渐降低;病毒侵染组合与叶片表型症状无明显对应关系。     

侵染冬瓜的病毒病原种类鉴定

本研究在我国主要冬瓜产区采集具有典型病毒病症状的病叶材料105份,根据葫芦科作物上常见的5种病毒病原的CP基因设计特异性引物,对105份待检冬瓜材料进行RT-PCR检测。检测结果表明:5对特异引物可分别在105份待检材料的95份中检测到小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)4种病毒,未检测到南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV);并且发现不同的冬瓜主产区致病的病毒种类有较大差异;同时还发现,在这些待检样品中4种病毒复合侵染现象较普遍,其中以PRSV与WMV组合最常见,占复合侵染现象的31.25%;未发现有4种病毒复合侵染。     

河北省番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒复合侵染及分布

 番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 及番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)是危害番茄的主要病毒。2016~2017年,在河北省18个番茄主产区调查番茄病毒病危害情况,采集262份植株矮化、叶片黄化、褪绿、卷曲的番茄样品,利用分子生物学技术对病原进行鉴定。结果表明:2016~2017年河北省番茄病毒病发生普遍,所检样品中TYLCV的侵染率为68.66%,其中与ToCV复合侵染率为19.5%;除栾城、滦南、乐亭、永年4地样品暂未检测到ToCV外,其他14个采样点的样品均检测到ToCV,侵染率为19.5%,且全部表现为与TYLCV复合侵染,河北省番茄主产区暂未发现ToCV单独侵染的样品。     

侵染云南早春西瓜的西瓜银色斑驳病毒和黄瓜花叶病毒分离鉴定

早春西瓜是云南热区的特色水果,近年来病毒病发生危害日益严重。为明确侵染早春西瓜的主要病毒,本研究采集了云南省西双版纳州勐海县的早春西瓜植株与果实病毒病样品,应用透射电子显微镜制样观察、间接酶联免疫吸附测定(ID-ELISA)和RT-PCR扩增克隆与测序分析进行检测鉴定。结果表明：侵染早春西瓜的病毒为西瓜银色斑驳病毒(WSMoV)和黄瓜花叶病毒(CMV);ID-ELISA对叶部样品WSMoV和CMV的检出率分别为70%和20%,复合侵染率为15%,RT-PCR对这两种病毒的检出率分别为100%和65%,复合侵染率为65%;并且,实验对发病果实种子进行RT-PCR扩增克隆和测序分析发现上述2种病毒复合侵染率达100%;系统发育树分析表明,云南西瓜WSMoV分离株21YV-40(GenBank登录号：OP617563)、21YV-43(GenBank登录号：OP867047)与云南分离株Banna-2011(GenBank登录号：KM242056)相似性最高,达到99.00%,云南西瓜CMV分离株CMVYN40(GenBank登录号：OP617565)、CMVYN46(GenBank登录号：...