尖孢镰刀菌番茄专化型中SNARE蛋白FolSso1的功能分析

 SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白保守存在于丝状真菌中,在膜泡转运的过程中起着关键的作用。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,Fol)引起的,严重威胁着番茄的生产。我们使用反向遗传学的方法来研究番茄枯萎病菌中SNARE蛋白FolSso1的功能,实验结果发现FolSSO1的基因缺失突变体菌丝生长速率降低,且产孢数量减少。另外,FolSSO1基因的缺失导致突变体相较于野生型菌株对细胞壁压力与细胞膜压力更加敏感。然后,在番茄果实和番茄植株的致病性实验中,我们发现FolSSO1的缺失并没有引起Fol致病性显著的变化。综上所述,本研究发现FolSSO1可以调控Fol营养生长,繁殖和对环境压力的响应过程,然而对Fol的致病过程并没有显著的调控作用。     

尖孢镰刀菌磷脂脂肪酸的遗传多样性分析

为明确尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum不同专化型菌株的遗传多样性,利用MIDI微生物脂肪酸鉴定系统分析了来源于5个专化型的27株菌株的磷脂脂肪酸种类和含量,并进行了磷脂脂肪酸聚类分析。结果表明,供试尖孢镰刀菌中共检测到9种脂肪酸,在兰氏距离为25.98时分为3个类群,即主要脂肪酸、微量脂肪酸和偶现脂肪酸,其中主要脂肪酸有16:0、18:0、18:1cis9(ω9)和18:2cis9,12/18:0a,含量共占总磷脂脂肪酸的96.41%;微量脂肪酸有14:0、15:0、16:1cis9(ω7)和20:0,偶现脂肪酸仅有17:1(ω11)。不同专化型菌株的主要脂肪酸仅18:2cis9,12/18:0a存在显著差异,微量脂肪酸除15:0外其余3种均有显著差异。聚类分析结果表明,以供试的全部27株菌株聚类时,其磷脂脂肪酸与寄主专化型间无明显相关性,以寄主来源为同科(葫芦科或茄科)的菌株聚类时,其磷脂脂肪酸与寄主专化型间存在着一定的对应关系。     

大蓟总黄酮对尖孢镰刀菌甜瓜专化型生长、生理的影响及其田间防治效果

为探究大蓟总黄酮对尖孢镰刀菌甜瓜专化型Fusarium oxysporum f. sp. melonis的抑制效果,采用微波超声法提取大蓟种子中的总黄酮,并测定其对其尖孢镰刀菌甜瓜专化型生长、生理指标的影响及其田间防治效果。结果显示,大蓟总黄酮浓度为10 mg/mL时,对尖孢镰刀菌甜瓜专化型的菌丝生长抑制率和孢子萌发抑制率达到100.0%,菌丝畸变、断裂;尖孢镰刀菌甜瓜专化型OD650 nm和pH最小,分别为0.3和5.5;其电导率是对照组1.2倍。不同浓度大蓟总黄酮处理下尖孢镰刀菌甜瓜专化型呼吸强度、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性均呈现先上升后下降的趋势,羧甲基纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活性降低,浓度为10 mg/mL大蓟总黄酮处理尖孢镰刀菌甜瓜专化型60 h后,呼吸强度、SOD和CAT活性均降至最低,分别为7.8 mgCO2·cm-2·h-1、22.9 U/mL和20.8 U/mL。田间防治结果表明,浓度为10 mg/mL大蓟总黄酮处理下,甜瓜枯萎株数最少,防治效果最佳,为93.5%。表明大蓟总黄酮能够有效地抑制尖孢镰刀菌甜瓜专化型生长,具有进一步发展为绿色新型植物源尖孢镰刀菌甜瓜专化型防治剂的能力。     

番茄尖孢镰刀菌诱导棉花抗枯萎病的效果——诱导棉花抗黄、枯萎病研究之三

 非致病的番茄尖孢镰刀菌[Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici (Sacc.) Snyder e Hansen]菌系F86-15经培养制成诱导菌菌剂,播种时用于浸种和沟施,可有效控制棉花枯萎病。在重病地区.经两年多点试验,其防效与多菌灵相当,比对照增产19.6%和20.3%。机理测试表明,诱导菌与挑战菌同时接种时,前者的接种量为后者的10倍,效果才明显。     

尖孢镰刀菌的遗传多态性

 尖孢镰刀菌是重要的植物维管束病原真菌。近年来,有关该菌的遗传多态性研究报道很多,本文着重综述了利用营养体亲和群、DNA多态性技术研究尖孢镰刀菌专化型、小种及其相互关系等方面的进展,同时介绍了对棉花枯萎病菌、瓜类枯萎病菌及尖孢镰刀菌小种起源等的研究概况。     

甜瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）专化型的初步研究

本研究获得的甜瓜枯萎病病株9株分离物（南通市6株,新疆3株）,经PDA培养性状发现,其在菌落颜色、质地和生长速率方面存在差异,大型分生孢子的大小为(19.54～41.11)μm×(4.90～8.16)μm,与西瓜枯萎病菌的大型分生孢子有较大差异。胚根法成株期致病性测定结果发现,本研究的甜瓜枯萎病菌分离物在不同鉴别寄主和鉴别品种上致病性存在专化型和生理小种方面的差异,但分离物中不存在西瓜枯萎病菌。利用核糖体转录间隔区保守序列设计引物,PCR检测也证明本研究甜瓜枯萎病菌不同分离物中不存在西瓜枯萎病菌。     

西安地区番茄枯萎病尖镰孢菌的生理型鉴定

 西安地区番茄枯萎病早在60年代初就发现在东郊的分布和危害。70年代中后期推广满丝、特罗皮克等抗枯萎品种后,病情得到控制。     

禾谷镰刀菌中磷脂酰肌醇转运蛋白功能分析

磷脂酰肌醇转运蛋白(phosphatidylinositol transfer protein,PITP)保守存在于真核生物中,负责膜系统中磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱的转运,参与胞内的脂类信号调控过程。由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病严重威胁粮食产量和食品安全,而在禾谷镰刀菌的研究中发现磷脂信号网络中的关键元件参与病原菌致病过程的调控。我们利用基因敲除的方法对禾谷镰刀菌中PITP家族的功能进行分析,在禾谷镰刀菌中鉴定了7个PITP蛋白的编码基因,并成功获得了其单敲除突变体。通过表型分析发现,这7个基因的单敲除突变体在营养生长、无性及有性生殖和致病性方面与野生型菌株并无明显差异。研究结果表明:1)禾谷镰刀菌中的PITP基因并不是看家基因;2)不同PITP基因之间可能存在功能冗余;3)丝状真菌中PITP的生理功能与酵母中的PITP存在显著差异。     

非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290的定殖特性及对番茄枯萎病的防治效果

为评价非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290对不同植物的致病性和定殖能力,利用该菌株所含的无毒基因SIX1特异性检测引物P12-R1/P12-F2跟踪其在不同植物中的侵入与定殖情况,并研究其对番茄植株生长特性的影响及对番茄枯萎病的防治效果。结果显示,接种120 d内,菌株FJAT-9290对所供试的11种植物均未造成危害,但在侵入时间与定殖方面存在差异。该菌株最易侵入番茄植株,接种第5天即可在茎基部检测到;其次为甜椒、甜瓜、西瓜和香蕉等植株,接种10 d时可在茎基部检测到;但在韭菜、香葱和马唐草上均未检测到。该菌株在番茄与茄子植株的定殖时间最长,达90 d;其次为甜椒、香蕉和粉蕉,至少60 d;在甜瓜、西瓜和黄瓜上为40~50 d。该菌株能促进番茄植株生长,显著提高其株高和叶片数量,对番茄枯萎病的盆栽与田间防治效果分别达76.70%和69.56%。表明菌株FJAT-9290具有良好的定殖能力且对番茄枯萎病具有较好的防治效果。     

非无菌操作下分离尖孢镰刀菌的培养基

 尖孢镰刀菌(F.oxysporum)是一类非常重要的土传病原真菌,寄主范围广,可引起100多种植物的萎蔫型病害。     

金属蛋白酶FocM352在香蕉枯萎病菌热带4号生理小种侵染过程中的功能

香蕉枯萎病菌热带4号生理小种(Fusarium oxysporum f. sp.cubense tropical race 4,Foc TR4)严重威胁世界香蕉产业的可持续发展，一些特殊功能的蛋白在其侵染过程中起重要作用。我们分析Foc TR4接种巴西蕉后的转录组数据发现M35金属蛋白酶(metalloprotease 35)同源基因FocM35＿2在病原菌侵染初期受诱导显著上调表达，经同源重组法敲除该基因，突变体致病力显著下降，菌丝生长速率降低，产孢量略微减少，回补突变体则可以恢复其致病力和生长发育；与野生型菌株相比较，突变体对外源氧胁迫、渗透压和细胞膜压力更敏感；在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中的瞬时表达结果显示该蛋白定位于质外体，并引起叶片产生超敏反应(HR,hypersensitive response);该蛋白的缺失还能够诱导寄主更高水平几丁质酶的活性。因此，FocM35＿2是促进Foc TR4侵染寄主的的重要致病因子。     

番茄枯萎病菌转录因子FolMsn2的生物学功能

为探究转录因子FolMsn2在番茄枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici生长发育及致病过程中的作用,以番茄枯萎病菌野生型菌株4287为材料,利用基因敲除方法获得FolMSN2基因缺失突变体△Folmsn2及回补体菌株△Folmsn2-C,通过测定菌株的生长速率、孢子产量及致病力等表型初步分析番茄枯萎病菌中FolMSN2的生物学功能。结果显示,与野生型菌株4287相比,FolMSN2基因敲除突变体△Folmsn2生长速率显著减慢,菌株产孢量显著下降,仅为野生型菌株4287产孢量的6.7%;外界环境压力胁迫试验结果显示,FolMSN2基因缺失突变体△Folmsn2对渗透压、盐胁迫的敏感性显著提高,而对细胞壁、氧化压力胁迫变得更加耐受。此外,FolMSN2基因缺失突变体△Folmsn2对番茄苗及果实的致病力显著下降,进一步分析发现FolMSN2基因缺失影响其对玻璃纸的穿透能力;亚细胞定位结果表明,FolMsn2蛋白定位于细胞核内。表明FolMsn2参与调控番茄枯萎病菌的营养生长、无性繁殖以及对不同环境胁迫的应答过程,其可能通过影响菌丝对寄主的穿透能...     

香蕉枯萎病菌myosin-1基因的功能分析及外施dsRNA介导的抗性评估

 香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中 4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor domain, MMD),肌动蛋白尾结构TH1(myosin tail)和 Src家族同源结构域SH3(src homology domain 3),与禾谷镰刀菌中氰烯菌酯靶标基因myosin-5具高度的蛋白同源性,相似性高达83%。利用Split-marker基因重组技术获得Foc4的myosin-1基因敲除突变体,Δmyosin-1突变株丧失了对氰烯菌酯的敏感性,菌丝生长缓慢,产孢量减少且孢子畸形,对香蕉致病力严重下降,证实myosin-1是氰烯菌酯在Foc4中的作用靶标基因。外施靶向myosin-1体外转录的dsRNA,能抑制菌丝的生长,降低菌丝活性;菌丝膨胀扭曲分枝增多,出现典型的球状结构,与氰烯菌酯处理后的表型一致。在盆栽活体人工接种实验中,体外施用dsRNA可以明显抑制枯萎病外部症状的发展,推迟发病时间,赋予寄主抗性,结果说明体外施用dsRNA可以作为新型杀菌剂防治香蕉枯萎病。综上,myosin-1基因作为氰烯菌酯在Foc4中的靶标基因具有高度的序列保守,在调控菌丝生长发育,产孢以及致病力等方面发挥重要作用,而外施dsRNA具有防治香蕉枯萎菌的巨大潜力。     

香蕉枯萎病菌1号小种分泌蛋白与效应子的预测与分析

由尖孢镰刀菌古巴专化型1号小种(Fusarium oxysporum f. sp.cubense race 1,Foc1)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产上的毁灭性病害之一。分泌蛋白作为一类重要致病因子,在Foc1与香蕉互作过程中起着重要作用。本文利用SignalP、WoLF PSORT、TargetP、TMHMM和big-PI Predictor等生物信息学软件,对Foc1全基因组编码的15 438条蛋白质氨基酸序列进行了分泌蛋白及效应子的预测分析。结果表明,Foc1全基因组编码蛋白中有988个经典分泌蛋白,占编码蛋白总数的6.40%。蛋白特征分析表明,其氨基酸长度主要集中在101～500个氨基酸(占总数的71.26%),信号肽长度集中在17～20个氨基酸(占61.94%),信号肽切割位点以SPaseⅠ型为主(占92.91%)。碳水化合物酶类(CAZymes)分析表明,有281个分泌蛋白属于CAZymes,其中以糖苷水解酶家族最多。对细胞壁降解酶类分析表明,有27个分泌蛋白属于纤维素降解酶类,73个属于果胶降解酶类,42个属于木聚糖降解酶类。以氨基酸长度≤400和半胱氨酸残基数≥4为筛选条...     

基于URP-PCR多态性片段的苦瓜枯萎病菌特异性检测技术的建立

 通过URP(Universal Rice Primers)-PCR分析尖孢镰孢菌苦瓜专化型基因组DNA扩增片段多态性,筛选检测尖孢镰孢菌苦瓜专化型的特异性引物,并建立了基于该引物的PCR检测方法。结果表明,特异性引物为FOMM-SPF/FOMM-SPR, PCR检测体系为25 SymbolmAL,包括2SymboltB Green Taq Master Mix 12.5 SymbolmAL,10 mmol·L^-1 的上下游引物各1 SymbolmAL,模板DNA 1 SymbolmAL,灭菌去离子水补足至25 SymbolmAL;PCR程序为95℃预变性3 min,94℃变性15 s,57℃退火30 s,72℃延伸20 s,共30个循环,循环结束后72℃延伸5 min;特异性扩增片段大小294 bp,检测灵敏度为2 ng·μL^-1 DNA或50个孢子·500 mg^-1土壤。该引物及其检测方法对尖孢镰孢菌苦瓜专化型的检测特异性好、灵敏度高,可以从土壤和植物样品中快速准确地检测出苦瓜枯萎病菌,无需病原菌的分离培养和致病性检测,对苦瓜枯萎病的早期诊断和预警及有效防控具有重要的指导意义。     

基于RNA-seq的香蕉枯萎病菌转录因子FoSwi6敲除突变体的转录组分析

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPK)信号通路转录因子FoSwi6在调控香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporumf.sp.cubense race 4,Foc4)的生理特性和致病性方面发挥着重要作用.为解析转录因子FoSwi6的转录调控机制...     

恶霉灵与溴菌腈混配对香蕉枯萎病菌的抑制效果

分别以孢子萌发法与菌丝生长法测定了噁霉灵与溴菌腈5种不同配比混配制剂对香蕉枯萎病菌的毒力.结果表明,不同配比的噁霉灵与溴菌腈的混配制剂都有不同程度的增效作用,其中以噁霉灵∶溴菌腈=2∶1的混配制剂增效作用最为显著,孢子萌发法和菌丝生长法的共毒系数分别为220和262.按噁霉灵∶溴菌腈=2∶1制成的45%噁霉灵*溴菌腈WP处理蕉园土中的孢子和菌丝,300～225 mg/L药液对孢子和菌丝的抑制率均达95%以上;处理香蕉枯萎病菌接种过10天的盆栽香蕉组培苗,20天后的防效达80%,比25%溴菌腈WP 625 mg/L和90%噁霉灵SP 300 mg/L的防治效果分别提高53%和14%.     

苦瓜枯萎病菌过氧化氢酶基因FoCat1致病功能分析

 由尖孢镰孢菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.momdicae Sun &Huang)引起的苦瓜枯萎病是一种严重影响苦瓜生产的土传维管束病害。本研究利用分割标记的方法构建FoCat1基因的敲除片段,通过PEG介导的原生质体转化方法对FoCat1基因进行敲除,经4对引物验证得到1个阳性转化子ΔFoCat1-3。突变体ΔFoCat1-3在PDA培养基上的菌落大小、菌丝形态、产孢量等生物学特性与野生型相比均无显著性差异,但是其抵抗外源氧胁迫的能力明显减弱,对苦瓜的致病力明显下降。DAB染色结果显示,接种突变体的苦瓜叶片中过氧化氢的含量明显高于接种野生型菌株的苦瓜叶片。研究结果表明,FoCat1可能不参与病菌正常营养生长过程的调控,但是具有清除寄主产生的活性氧,来减弱寄主对病原菌的杀伤作用的功能,从而参与病原菌的致病过程。     

苦瓜枯萎病菌过氧化氢酶基因FoCat1致病功能分析

 由尖孢镰孢菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.momdicae Sun &Huang)引起的苦瓜枯萎病是一种严重影响苦瓜生产的土传维管束病害。本研究利用分割标记的方法构建FoCat1基因的敲除片段,通过PEG介导的原生质体转化方法对FoCat1基因进行敲除,经4对引物验证得到1个阳性转化子ΔFoCat1-3。突变体ΔFoCat1-3在PDA培养基上的菌落大小、菌丝形态、产孢量等生物学特性与野生型相比均无显著性差异,但是其抵抗外源氧胁迫的能力明显减弱,对苦瓜的致病力明显下降。DAB染色结果显示,接种突变体的苦瓜叶片中过氧化氢的含量明显高于接种野生型菌株的苦瓜叶片。研究结果表明,FoCat1可能不参与病菌正常营养生长过程的调控,但是具有清除寄主产生的活性氧,来减弱寄主对病原菌的杀伤作用的功能,从而参与病原菌的致病过程。